中國農(nóng)大新聞網(wǎng)訊 1月13日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究中心與中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所合作于Nature Plants期刊上（DOI: 10.1038/s41477-024-01898-3）在線發(fā)表了題為“Precise deletion, replacement, and inversion of large DNA fragments in plants using dual prime editing”的研究論文。該研究開發(fā)了一種高效精準(zhǔn)的植物大片段DNA操縱和染色體編輯技術(shù)，拓展了植物精準(zhǔn)基因組編輯的尺度，為復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)變異的創(chuàng)制提供了新策略。同時為生物育種技術(shù)的創(chuàng)新、植物合成生物學(xué)研究以及植物新性狀乃至新型植物的創(chuàng)制提供了重要的技術(shù)支撐。
基因組結(jié)構(gòu)變異（Structural Variants, SV）是植物遺傳多樣性的重要來源，也是基因組進(jìn)化和優(yōu)異農(nóng)藝性狀形成的重要驅(qū)動力。因此，探究如何高效精準(zhǔn)地操縱植物基因組結(jié)構(gòu)變異對植物性狀改良和農(nóng)業(yè)生物育種具有重要意義。目前，基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術(shù)，包括Cas核酸酶、堿基編輯（base editors, BE）和引導(dǎo)編輯（Prime editor, PE）等，已在植物性狀改良中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，這些技術(shù)的編輯范圍大部分情況下仍然局限于少數(shù)幾個核苷酸的替換、刪除和插入。盡管CRISPR/Cas9結(jié)合雙sgRNAs能夠在植物中實現(xiàn)基因組大片段的刪除和倒位等操縱，但其效率較低，并且由于該策略依賴于DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks, DSBs）的產(chǎn)生，編輯產(chǎn)物中常常會引入許多非預(yù)期的編輯，甚至導(dǎo)致復(fù)雜的染色體重排。因此，開發(fā)不依賴于DSBs、高效且精準(zhǔn)的大片段DNA和染色體操縱技術(shù)，對植物遺傳改良具有重要意義，也是植物染色體工程和生物育種技術(shù)創(chuàng)新的迫切需求。
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究中心與中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所合作，開發(fā)了一種高效且精準(zhǔn)的植物基因組大片段DNA操縱技術(shù)（DualPE）。該技術(shù)能夠在單子葉植物普通小麥以及雙子葉植物本氏煙草和番茄中實現(xiàn)kb至Mb級的大片段DNA精準(zhǔn)無縫的刪除、替換和倒位。具體開發(fā)思路為：利用植物高效引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（Ni et al, Genome Biology, 2023），在目標(biāo)編輯的染色體片段的兩端以PAM-in的形式創(chuàng)制一對反向的3′ DNA flaps。通過對這兩個3′ DNA flaps的序列和配對方式進(jìn)行操縱，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)方式發(fā)生相應(yīng)的改變，從而實現(xiàn)該染色體片段的精準(zhǔn)無縫刪除、替換和倒位。
首先，當(dāng)兩個3′ DNA flaps與彼此靶位點(diǎn)區(qū)域的DNA序列互補(bǔ)配對時，經(jīng)過DNA修復(fù)，理論上可以實現(xiàn)靶向位點(diǎn)之間大片段DNA的精準(zhǔn)刪除（圖1）。對小麥7個內(nèi)源片段（507bp-365.9kb）進(jìn)行刪除效率與精準(zhǔn)度的測試，發(fā)現(xiàn)DualPE在大多數(shù)位點(diǎn)上的編輯效率高于對照組（WT-DualPE和Cas9），或至少相當(dāng)。且DualPE完全精準(zhǔn)編輯的產(chǎn)物比例（平均為95.3%）明顯高于對照組。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，DualPE能夠在小麥個體水平高效創(chuàng)制365.9kb和2Mb的基因組片段精準(zhǔn)刪除的突變體。這一方法的精準(zhǔn)性和可操縱性證明了DualPE具備開放閱讀框內(nèi)刪除（in-frame deletions）和多片段同時刪除的潛力。其次，當(dāng)兩個3′ DNA flaps包含外源目標(biāo)插入片段且兩個3′ flaps序列部分互補(bǔ)時，經(jīng)過DNA鏈的延伸和修復(fù)，理論上可實現(xiàn)靶向區(qū)域的大片段DNA精準(zhǔn)替換。小麥原生質(zhì)體測試結(jié)果表明，DualPE可將超過250kb的序列替換為~90bp的序列。更重要的是，DualPE成功創(chuàng)制了VRT-A2基因的內(nèi)含子序列替換小麥突變體（560bp的轉(zhuǎn)錄抑制元件替換為157bp的增強(qiáng)子元件），從而使該基因在穗部上調(diào)表達(dá)，獲得了穗長和粒長明顯增加的小麥材料。研究結(jié)果凸顯了DualPE在修改調(diào)控元件和改變基因表達(dá)模式方面的潛力，同時也為基因組原位標(biāo)簽插入提供了有效的方法。再次，如果兩個3′ DNA flaps分別與目標(biāo)倒位區(qū)域左右末端序列互補(bǔ)配對，就可以改變DNA復(fù)制方向，經(jīng)過DNA修復(fù)，最終實現(xiàn)靶向區(qū)域的大片段DNA精準(zhǔn)倒位。小麥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果表明，DualPE可實現(xiàn)~700bp-252kb的大片段DNA倒位，且其精準(zhǔn)度均達(dá)到95%以上。小麥遺傳轉(zhuǎn)化實驗證明，該系統(tǒng)可以在小麥個體水平上實現(xiàn)基因組7.4kb-205.4kb的高效精準(zhǔn)倒位，突變率為21.9-51.5%，其中兩個基因(GASR7和SOG1)的啟動子發(fā)生了交換，導(dǎo)致這兩個基因各自的表達(dá)模式發(fā)生轉(zhuǎn)變。這種大片段DNA倒位技術(shù)為染色體定向重排、改變基因表達(dá)模式以及打破基因連鎖提供了強(qiáng)有力的工具。
此外，針對雙子葉植物在精準(zhǔn)基因組編輯技術(shù)，尤其是大片段精準(zhǔn)編輯工具開發(fā)方面的不足，該研究同時探索了DualPE系統(tǒng)在雙子葉植物中的編輯潛力。該研究首先對適用于雙子葉植物本氏煙草和番茄的引導(dǎo)編輯載體進(jìn)行了改造，分別使用了2×35S和EF1α啟動子來驅(qū)動ePPEplus蛋白的表達(dá)。通過進(jìn)一步的實驗驗證，發(fā)現(xiàn)DualPE在本氏煙草葉片基因組中能夠?qū)崿F(xiàn)長達(dá)134.7kb的刪除、1.6kb的刪除與66bp的替換、以及20.1kb的倒位。番茄原生質(zhì)體和遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，DualPE系統(tǒng)可以實現(xiàn)番茄基因組725bp-10kb的大片段刪除、替換和倒位，效率高達(dá)72.7%。并且在T0代即可獲得高達(dá)27.3%的純合精準(zhǔn)大片段編輯突變體。綜合以上結(jié)果，DualPE系統(tǒng)不僅在小麥等單子葉植物中表現(xiàn)出色，還能高效應(yīng)用于雙子葉植物（如本氏煙草和番茄）的大片段DNA精準(zhǔn)編輯，是單雙子葉植物染色體編輯的強(qiáng)大工具。另外，為方便用戶簡單、快速使用，該研究同時開發(fā)了網(wǎng)頁版設(shè)計工具DualPE-Finder（http://wheat.cau.edu.cn/DualPE_Finder/），旨在提供DualPE介導(dǎo)的大片段DNA編輯策略的選擇及設(shè)計方案。
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究中心的博士生趙一迪、碩士生黃正偉、博士生周希萌以及中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所的滕婉副研究員為該論文的共同第一作者。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究中心宗媛教授和中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所王延鵬研究員為該論文的共同通訊作者。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究中心孫其信院士、倪中福教授、劉杰教授、郭偉龍教授、柴嶺嶺副研究員，以及園藝學(xué)院張娜副教授對該工作給予了重要的指導(dǎo)和幫助。該項研究受到國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、生物育種重大專項、國家自然科學(xué)基金、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金等項目的資助。
孫其信院士作為學(xué)術(shù)帶頭人的中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究中心長期圍繞多倍體小麥廣適性的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制、小麥產(chǎn)量性狀形成、小麥品質(zhì)性狀遺傳調(diào)控等一系列重要科學(xué)問題開展系統(tǒng)深入的研究。該團(tuán)隊在“十三五”期間共獲得國家科技進(jìn)步二等獎1項，國家技術(shù)發(fā)明二等獎1項，教育部高?？蒲袃?yōu)秀成果技術(shù)發(fā)明獎一等獎1項，中華農(nóng)業(yè)科技獎優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊獎1項；近5年在小麥研究方向發(fā)表Nature、Nature Communications、The Plant Cell、Molecular Plant 等高水平研究論文50余篇。
日期：2025-01-29
基因組結(jié)構(gòu)變異（Structural Variants, SV）是植物遺傳多樣性的重要來源，也是基因組進(jìn)化和優(yōu)異農(nóng)藝性狀形成的重要驅(qū)動力。因此，探究如何高效精準(zhǔn)地操縱植物基因組結(jié)構(gòu)變異對植物性狀改良和農(nóng)業(yè)生物育種具有重要意義。目前，基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術(shù)，包括Cas核酸酶、堿基編輯（base editors, BE）和引導(dǎo)編輯（Prime editor, PE）等，已在植物性狀改良中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，這些技術(shù)的編輯范圍大部分情況下仍然局限于少數(shù)幾個核苷酸的替換、刪除和插入。盡管CRISPR/Cas9結(jié)合雙sgRNAs能夠在植物中實現(xiàn)基因組大片段的刪除和倒位等操縱，但其效率較低，并且由于該策略依賴于DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks, DSBs）的產(chǎn)生，編輯產(chǎn)物中常常會引入許多非預(yù)期的編輯，甚至導(dǎo)致復(fù)雜的染色體重排。因此，開發(fā)不依賴于DSBs、高效且精準(zhǔn)的大片段DNA和染色體操縱技術(shù)，對植物遺傳改良具有重要意義，也是植物染色體工程和生物育種技術(shù)創(chuàng)新的迫切需求。
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究中心與中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所合作，開發(fā)了一種高效且精準(zhǔn)的植物基因組大片段DNA操縱技術(shù)（DualPE）。該技術(shù)能夠在單子葉植物普通小麥以及雙子葉植物本氏煙草和番茄中實現(xiàn)kb至Mb級的大片段DNA精準(zhǔn)無縫的刪除、替換和倒位。具體開發(fā)思路為：利用植物高效引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（Ni et al, Genome Biology, 2023），在目標(biāo)編輯的染色體片段的兩端以PAM-in的形式創(chuàng)制一對反向的3′ DNA flaps。通過對這兩個3′ DNA flaps的序列和配對方式進(jìn)行操縱，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)方式發(fā)生相應(yīng)的改變，從而實現(xiàn)該染色體片段的精準(zhǔn)無縫刪除、替換和倒位。
首先，當(dāng)兩個3′ DNA flaps與彼此靶位點(diǎn)區(qū)域的DNA序列互補(bǔ)配對時，經(jīng)過DNA修復(fù)，理論上可以實現(xiàn)靶向位點(diǎn)之間大片段DNA的精準(zhǔn)刪除（圖1）。對小麥7個內(nèi)源片段（507bp-365.9kb）進(jìn)行刪除效率與精準(zhǔn)度的測試，發(fā)現(xiàn)DualPE在大多數(shù)位點(diǎn)上的編輯效率高于對照組（WT-DualPE和Cas9），或至少相當(dāng)。且DualPE完全精準(zhǔn)編輯的產(chǎn)物比例（平均為95.3%）明顯高于對照組。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，DualPE能夠在小麥個體水平高效創(chuàng)制365.9kb和2Mb的基因組片段精準(zhǔn)刪除的突變體。這一方法的精準(zhǔn)性和可操縱性證明了DualPE具備開放閱讀框內(nèi)刪除（in-frame deletions）和多片段同時刪除的潛力。其次，當(dāng)兩個3′ DNA flaps包含外源目標(biāo)插入片段且兩個3′ flaps序列部分互補(bǔ)時，經(jīng)過DNA鏈的延伸和修復(fù)，理論上可實現(xiàn)靶向區(qū)域的大片段DNA精準(zhǔn)替換。小麥原生質(zhì)體測試結(jié)果表明，DualPE可將超過250kb的序列替換為~90bp的序列。更重要的是，DualPE成功創(chuàng)制了VRT-A2基因的內(nèi)含子序列替換小麥突變體（560bp的轉(zhuǎn)錄抑制元件替換為157bp的增強(qiáng)子元件），從而使該基因在穗部上調(diào)表達(dá)，獲得了穗長和粒長明顯增加的小麥材料。研究結(jié)果凸顯了DualPE在修改調(diào)控元件和改變基因表達(dá)模式方面的潛力，同時也為基因組原位標(biāo)簽插入提供了有效的方法。再次，如果兩個3′ DNA flaps分別與目標(biāo)倒位區(qū)域左右末端序列互補(bǔ)配對，就可以改變DNA復(fù)制方向，經(jīng)過DNA修復(fù)，最終實現(xiàn)靶向區(qū)域的大片段DNA精準(zhǔn)倒位。小麥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果表明，DualPE可實現(xiàn)~700bp-252kb的大片段DNA倒位，且其精準(zhǔn)度均達(dá)到95%以上。小麥遺傳轉(zhuǎn)化實驗證明，該系統(tǒng)可以在小麥個體水平上實現(xiàn)基因組7.4kb-205.4kb的高效精準(zhǔn)倒位，突變率為21.9-51.5%，其中兩個基因(GASR7和SOG1)的啟動子發(fā)生了交換，導(dǎo)致這兩個基因各自的表達(dá)模式發(fā)生轉(zhuǎn)變。這種大片段DNA倒位技術(shù)為染色體定向重排、改變基因表達(dá)模式以及打破基因連鎖提供了強(qiáng)有力的工具。
此外，針對雙子葉植物在精準(zhǔn)基因組編輯技術(shù)，尤其是大片段精準(zhǔn)編輯工具開發(fā)方面的不足，該研究同時探索了DualPE系統(tǒng)在雙子葉植物中的編輯潛力。該研究首先對適用于雙子葉植物本氏煙草和番茄的引導(dǎo)編輯載體進(jìn)行了改造，分別使用了2×35S和EF1α啟動子來驅(qū)動ePPEplus蛋白的表達(dá)。通過進(jìn)一步的實驗驗證，發(fā)現(xiàn)DualPE在本氏煙草葉片基因組中能夠?qū)崿F(xiàn)長達(dá)134.7kb的刪除、1.6kb的刪除與66bp的替換、以及20.1kb的倒位。番茄原生質(zhì)體和遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，DualPE系統(tǒng)可以實現(xiàn)番茄基因組725bp-10kb的大片段刪除、替換和倒位，效率高達(dá)72.7%。并且在T0代即可獲得高達(dá)27.3%的純合精準(zhǔn)大片段編輯突變體。綜合以上結(jié)果，DualPE系統(tǒng)不僅在小麥等單子葉植物中表現(xiàn)出色，還能高效應(yīng)用于雙子葉植物（如本氏煙草和番茄）的大片段DNA精準(zhǔn)編輯，是單雙子葉植物染色體編輯的強(qiáng)大工具。另外，為方便用戶簡單、快速使用，該研究同時開發(fā)了網(wǎng)頁版設(shè)計工具DualPE-Finder（http://wheat.cau.edu.cn/DualPE_Finder/），旨在提供DualPE介導(dǎo)的大片段DNA編輯策略的選擇及設(shè)計方案。
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究中心的博士生趙一迪、碩士生黃正偉、博士生周希萌以及中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所的滕婉副研究員為該論文的共同第一作者。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究中心宗媛教授和中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所王延鵬研究員為該論文的共同通訊作者。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究中心孫其信院士、倪中福教授、劉杰教授、郭偉龍教授、柴嶺嶺副研究員，以及園藝學(xué)院張娜副教授對該工作給予了重要的指導(dǎo)和幫助。該項研究受到國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、生物育種重大專項、國家自然科學(xué)基金、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金等項目的資助。
孫其信院士作為學(xué)術(shù)帶頭人的中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究中心長期圍繞多倍體小麥廣適性的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制、小麥產(chǎn)量性狀形成、小麥品質(zhì)性狀遺傳調(diào)控等一系列重要科學(xué)問題開展系統(tǒng)深入的研究。該團(tuán)隊在“十三五”期間共獲得國家科技進(jìn)步二等獎1項，國家技術(shù)發(fā)明二等獎1項，教育部高?？蒲袃?yōu)秀成果技術(shù)發(fā)明獎一等獎1項，中華農(nóng)業(yè)科技獎優(yōu)秀創(chuàng)新團(tuán)隊獎1項；近5年在小麥研究方向發(fā)表Nature、Nature Communications、The Plant Cell、Molecular Plant 等高水平研究論文50余篇。
日期：2025-01-29
