中國農大新聞網訊 1月13日，中國農業大學農學院小麥研究中心與中國科學院遺傳與發育生物學研究所合作于Nature Plants期刊上（DOI: 10.1038/s41477-024-01898-3）在線發表了題為“Precise deletion, replacement, and inversion of large DNA fragments in plants using dual prime editing”的研究論文。該研究開發了一種高效精準的植物大片段DNA操縱和染色體編輯技術，拓展了植物精準基因組編輯的尺度，為復雜染色體結構變異的創制提供了新策略。同時為生物育種技術的創新、植物合成生物學研究以及植物新性狀乃至新型植物的創制提供了重要的技術支撐。
基因組結構變異（Structural Variants, SV）是植物遺傳多樣性的重要來源，也是基因組進化和優異農藝性狀形成的重要驅動力。因此，探究如何高效精準地操縱植物基因組結構變異對植物性狀改良和農業生物育種具有重要意義。目前，基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術，包括Cas核酸酶、堿基編輯（base editors, BE）和引導編輯（Prime editor, PE）等，已在植物性狀改良中得到了廣泛的應用。然而，這些技術的編輯范圍大部分情況下仍然局限于少數幾個核苷酸的替換、刪除和插入。盡管CRISPR/Cas9結合雙sgRNAs能夠在植物中實現基因組大片段的刪除和倒位等操縱，但其效率較低，并且由于該策略依賴于DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks, DSBs）的產生，編輯產物中常常會引入許多非預期的編輯，甚至導致復雜的染色體重排。因此，開發不依賴于DSBs、高效且精準的大片段DNA和染色體操縱技術，對植物遺傳改良具有重要意義，也是植物染色體工程和生物育種技術創新的迫切需求。
中國農業大學小麥研究中心與中國科學院遺傳與發育生物學研究所合作，開發了一種高效且精準的植物基因組大片段DNA操縱技術（DualPE）。該技術能夠在單子葉植物普通小麥以及雙子葉植物本氏煙草和番茄中實現kb至Mb級的大片段DNA精準無縫的刪除、替換和倒位。具體開發思路為：利用植物高效引導編輯系統（Ni et al, Genome Biology, 2023），在目標編輯的染色體片段的兩端以PAM-in的形式創制一對反向的3′ DNA flaps。通過對這兩個3′ DNA flaps的序列和配對方式進行操縱，誘導細胞內的DNA修復方式發生相應的改變，從而實現該染色體片段的精準無縫刪除、替換和倒位。
首先，當兩個3′ DNA flaps與彼此靶位點區域的DNA序列互補配對時，經過DNA修復，理論上可以實現靶向位點之間大片段DNA的精準刪除（圖1）。對小麥7個內源片段（507bp-365.9kb）進行刪除效率與精準度的測試，發現DualPE在大多數位點上的編輯效率高于對照組（WT-DualPE和Cas9），或至少相當。且DualPE完全精準編輯的產物比例（平均為95.3%）明顯高于對照組。遺傳轉化結果表明，DualPE能夠在小麥個體水平高效創制365.9kb和2Mb的基因組片段精準刪除的突變體。這一方法的精準性和可操縱性證明了DualPE具備開放閱讀框內刪除（in-frame deletions）和多片段同時刪除的潛力。其次，當兩個3′ DNA flaps包含外源目標插入片段且兩個3′ flaps序列部分互補時，經過DNA鏈的延伸和修復，理論上可實現靶向區域的大片段DNA精準替換。小麥原生質體測試結果表明，DualPE可將超過250kb的序列替換為~90bp的序列。更重要的是，DualPE成功創制了VRT-A2基因的內含子序列替換小麥突變體（560bp的轉錄抑制元件替換為157bp的增強子元件），從而使該基因在穗部上調表達，獲得了穗長和粒長明顯增加的小麥材料。研究結果凸顯了DualPE在修改調控元件和改變基因表達模式方面的潛力，同時也為基因組原位標簽插入提供了有效的方法。再次，如果兩個3′ DNA flaps分別與目標倒位區域左右末端序列互補配對，就可以改變DNA復制方向，經過DNA修復，最終實現靶向區域的大片段DNA精準倒位。小麥原生質體瞬時轉化實驗結果表明，DualPE可實現~700bp-252kb的大片段DNA倒位，且其精準度均達到95%以上。小麥遺傳轉化實驗證明，該系統可以在小麥個體水平上實現基因組7.4kb-205.4kb的高效精準倒位，突變率為21.9-51.5%，其中兩個基因(GASR7和SOG1)的啟動子發生了交換，導致這兩個基因各自的表達模式發生轉變。這種大片段DNA倒位技術為染色體定向重排、改變基因表達模式以及打破基因連鎖提供了強有力的工具。
此外，針對雙子葉植物在精準基因組編輯技術，尤其是大片段精準編輯工具開發方面的不足，該研究同時探索了DualPE系統在雙子葉植物中的編輯潛力。該研究首先對適用于雙子葉植物本氏煙草和番茄的引導編輯載體進行了改造，分別使用了2×35S和EF1α啟動子來驅動ePPEplus蛋白的表達。通過進一步的實驗驗證，發現DualPE在本氏煙草葉片基因組中能夠實現長達134.7kb的刪除、1.6kb的刪除與66bp的替換、以及20.1kb的倒位。番茄原生質體和遺傳轉化結果表明，DualPE系統可以實現番茄基因組725bp-10kb的大片段刪除、替換和倒位，效率高達72.7%。并且在T0代即可獲得高達27.3%的純合精準大片段編輯突變體。綜合以上結果，DualPE系統不僅在小麥等單子葉植物中表現出色，還能高效應用于雙子葉植物（如本氏煙草和番茄）的大片段DNA精準編輯，是單雙子葉植物染色體編輯的強大工具。另外，為方便用戶簡單、快速使用，該研究同時開發了網頁版設計工具DualPE-Finder（http://wheat.cau.edu.cn/DualPE_Finder/），旨在提供DualPE介導的大片段DNA編輯策略的選擇及設計方案。
中國農業大學農學院小麥研究中心的博士生趙一迪、碩士生黃正偉、博士生周希萌以及中國科學院遺傳發育所的滕婉副研究員為該論文的共同第一作者。中國農業大學農學院小麥研究中心宗媛教授和中國科學院遺傳發育所王延鵬研究員為該論文的共同通訊作者。中國農業大學農學院小麥研究中心孫其信院士、倪中福教授、劉杰教授、郭偉龍教授、柴嶺嶺副研究員，以及園藝學院張娜副教授對該工作給予了重要的指導和幫助。該項研究受到國家重點研發計劃、生物育種重大專項、國家自然科學基金、中央高校基本科研業務費專項資金等項目的資助。
孫其信院士作為學術帶頭人的中國農業大學小麥研究中心長期圍繞多倍體小麥廣適性的遺傳基礎和分子機制、小麥產量性狀形成、小麥品質性狀遺傳調控等一系列重要科學問題開展系統深入的研究。該團隊在“十三五”期間共獲得國家科技進步二等獎1項，國家技術發明二等獎1項，教育部高校科研優秀成果技術發明獎一等獎1項，中華農業科技獎優秀創新團隊獎1項；近5年在小麥研究方向發表Nature、Nature Communications、The Plant Cell、Molecular Plant 等高水平研究論文50余篇。
日期：2025-01-29
基因組結構變異（Structural Variants, SV）是植物遺傳多樣性的重要來源，也是基因組進化和優異農藝性狀形成的重要驅動力。因此，探究如何高效精準地操縱植物基因組結構變異對植物性狀改良和農業生物育種具有重要意義。目前，基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術，包括Cas核酸酶、堿基編輯（base editors, BE）和引導編輯（Prime editor, PE）等，已在植物性狀改良中得到了廣泛的應用。然而，這些技術的編輯范圍大部分情況下仍然局限于少數幾個核苷酸的替換、刪除和插入。盡管CRISPR/Cas9結合雙sgRNAs能夠在植物中實現基因組大片段的刪除和倒位等操縱，但其效率較低，并且由于該策略依賴于DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks, DSBs）的產生，編輯產物中常常會引入許多非預期的編輯，甚至導致復雜的染色體重排。因此，開發不依賴于DSBs、高效且精準的大片段DNA和染色體操縱技術，對植物遺傳改良具有重要意義，也是植物染色體工程和生物育種技術創新的迫切需求。
中國農業大學小麥研究中心與中國科學院遺傳與發育生物學研究所合作，開發了一種高效且精準的植物基因組大片段DNA操縱技術（DualPE）。該技術能夠在單子葉植物普通小麥以及雙子葉植物本氏煙草和番茄中實現kb至Mb級的大片段DNA精準無縫的刪除、替換和倒位。具體開發思路為：利用植物高效引導編輯系統（Ni et al, Genome Biology, 2023），在目標編輯的染色體片段的兩端以PAM-in的形式創制一對反向的3′ DNA flaps。通過對這兩個3′ DNA flaps的序列和配對方式進行操縱，誘導細胞內的DNA修復方式發生相應的改變，從而實現該染色體片段的精準無縫刪除、替換和倒位。
首先，當兩個3′ DNA flaps與彼此靶位點區域的DNA序列互補配對時，經過DNA修復，理論上可以實現靶向位點之間大片段DNA的精準刪除（圖1）。對小麥7個內源片段（507bp-365.9kb）進行刪除效率與精準度的測試，發現DualPE在大多數位點上的編輯效率高于對照組（WT-DualPE和Cas9），或至少相當。且DualPE完全精準編輯的產物比例（平均為95.3%）明顯高于對照組。遺傳轉化結果表明，DualPE能夠在小麥個體水平高效創制365.9kb和2Mb的基因組片段精準刪除的突變體。這一方法的精準性和可操縱性證明了DualPE具備開放閱讀框內刪除（in-frame deletions）和多片段同時刪除的潛力。其次，當兩個3′ DNA flaps包含外源目標插入片段且兩個3′ flaps序列部分互補時，經過DNA鏈的延伸和修復，理論上可實現靶向區域的大片段DNA精準替換。小麥原生質體測試結果表明，DualPE可將超過250kb的序列替換為~90bp的序列。更重要的是，DualPE成功創制了VRT-A2基因的內含子序列替換小麥突變體（560bp的轉錄抑制元件替換為157bp的增強子元件），從而使該基因在穗部上調表達，獲得了穗長和粒長明顯增加的小麥材料。研究結果凸顯了DualPE在修改調控元件和改變基因表達模式方面的潛力，同時也為基因組原位標簽插入提供了有效的方法。再次，如果兩個3′ DNA flaps分別與目標倒位區域左右末端序列互補配對，就可以改變DNA復制方向，經過DNA修復，最終實現靶向區域的大片段DNA精準倒位。小麥原生質體瞬時轉化實驗結果表明，DualPE可實現~700bp-252kb的大片段DNA倒位，且其精準度均達到95%以上。小麥遺傳轉化實驗證明，該系統可以在小麥個體水平上實現基因組7.4kb-205.4kb的高效精準倒位，突變率為21.9-51.5%，其中兩個基因(GASR7和SOG1)的啟動子發生了交換，導致這兩個基因各自的表達模式發生轉變。這種大片段DNA倒位技術為染色體定向重排、改變基因表達模式以及打破基因連鎖提供了強有力的工具。
此外，針對雙子葉植物在精準基因組編輯技術，尤其是大片段精準編輯工具開發方面的不足，該研究同時探索了DualPE系統在雙子葉植物中的編輯潛力。該研究首先對適用于雙子葉植物本氏煙草和番茄的引導編輯載體進行了改造，分別使用了2×35S和EF1α啟動子來驅動ePPEplus蛋白的表達。通過進一步的實驗驗證，發現DualPE在本氏煙草葉片基因組中能夠實現長達134.7kb的刪除、1.6kb的刪除與66bp的替換、以及20.1kb的倒位。番茄原生質體和遺傳轉化結果表明，DualPE系統可以實現番茄基因組725bp-10kb的大片段刪除、替換和倒位，效率高達72.7%。并且在T0代即可獲得高達27.3%的純合精準大片段編輯突變體。綜合以上結果，DualPE系統不僅在小麥等單子葉植物中表現出色，還能高效應用于雙子葉植物（如本氏煙草和番茄）的大片段DNA精準編輯，是單雙子葉植物染色體編輯的強大工具。另外，為方便用戶簡單、快速使用，該研究同時開發了網頁版設計工具DualPE-Finder（http://wheat.cau.edu.cn/DualPE_Finder/），旨在提供DualPE介導的大片段DNA編輯策略的選擇及設計方案。
中國農業大學農學院小麥研究中心的博士生趙一迪、碩士生黃正偉、博士生周希萌以及中國科學院遺傳發育所的滕婉副研究員為該論文的共同第一作者。中國農業大學農學院小麥研究中心宗媛教授和中國科學院遺傳發育所王延鵬研究員為該論文的共同通訊作者。中國農業大學農學院小麥研究中心孫其信院士、倪中福教授、劉杰教授、郭偉龍教授、柴嶺嶺副研究員，以及園藝學院張娜副教授對該工作給予了重要的指導和幫助。該項研究受到國家重點研發計劃、生物育種重大專項、國家自然科學基金、中央高校基本科研業務費專項資金等項目的資助。
孫其信院士作為學術帶頭人的中國農業大學小麥研究中心長期圍繞多倍體小麥廣適性的遺傳基礎和分子機制、小麥產量性狀形成、小麥品質性狀遺傳調控等一系列重要科學問題開展系統深入的研究。該團隊在“十三五”期間共獲得國家科技進步二等獎1項，國家技術發明二等獎1項，教育部高校科研優秀成果技術發明獎一等獎1項，中華農業科技獎優秀創新團隊獎1項；近5年在小麥研究方向發表Nature、Nature Communications、The Plant Cell、Molecular Plant 等高水平研究論文50余篇。
日期：2025-01-29
