近日，免疫所禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團隊在酵母表達納米抗體方面取得重要進展，研究成果以題為“AUniversal Strategy for the Efficient expression of Nanobodies inPichia pastoris”發(fā)表于《Fermentation》雜志。
在駱駝科和鯊魚科動物的血清中天然存在輕鏈缺失的抗體，其重鏈的可變區(qū)是已知有效結合完整抗原片段的最小單元，因此被稱為納米抗體。近年來，納米抗體在疾病治療、成像診斷、病毒中和以及ELISA檢測等方面發(fā)揮著關鍵性作用。畢赤酵母無內毒素風險，具有較強的分泌表達能力，能夠以低廉的成本進行高密度發(fā)酵，因此是表達納米抗體的理想宿主。畢赤酵母生產的多種納米抗體藥物如ALX-0061、ALX-0171、Everestmab等已進入臨床階段。本研究利用Va、Vb和Vc三種納米抗體作為模式蛋白，探索通用型納米抗體高效表達技術。
首先，通過改變lox71的位置構建出能夠實現(xiàn)雙抗性基因敲除的親本質粒pLD。啟動子和信號肽的優(yōu)化使Va產量分別增加1.38倍和1.89倍。優(yōu)化基因劑量可使Va產量提高1.39倍。在野生型AOX1啟動子的控制下25種分子伴侶蛋白與Va共表達，其中HAC1使Va產量提高1.5倍。在此基礎上使用弱化的AOX1啟動子突變體55p對HAC1的表達強度進行微調，Va產量進一步增加2.41倍。最后通過高密度發(fā)酵Va產量達到2.13g/L，與初始菌株1-AOXα-Va的搖瓶表達產量相比提高49.8倍。將pLD-55p-HAC1質粒整合到GS115基因組中形成預整合HAC1分子伴侶的H55宿主，將多拷貝質粒轉化到該宿主后Vb和Vc產量分別增加1.98倍和2.34倍。無抗生素親本質粒的工程設計、表達元件的修飾、基因劑量的優(yōu)化以及H55宿主被組合成一種復合策略，為未來納米抗體的高效酵母表達鋪平道路。
無抗化畢赤酵母表達平臺是禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團隊的核心表達平臺之一，基于該平臺多種酶制劑的產量已達到10g/L以上水平。重組人膠原蛋白、塑料降解酶、KEX2、腸激酶、犬α干擾素、貓犬白蛋白及CSFVE2抗原、PCV3Cap抗原等重組蛋白亦借助該平臺實現(xiàn)高效表達。
碩士研究生鄭毅恒為論文第一作者，免疫所禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團隊李丁副研究員為論文通訊作者。該研究得到國家自然科學基金（32002316、31961133017）的資助。
文章鏈接：https://www.mdpi.com/2311-5637/10/1/37。
日期：2024-01-15
在駱駝科和鯊魚科動物的血清中天然存在輕鏈缺失的抗體，其重鏈的可變區(qū)是已知有效結合完整抗原片段的最小單元，因此被稱為納米抗體。近年來，納米抗體在疾病治療、成像診斷、病毒中和以及ELISA檢測等方面發(fā)揮著關鍵性作用。畢赤酵母無內毒素風險，具有較強的分泌表達能力，能夠以低廉的成本進行高密度發(fā)酵，因此是表達納米抗體的理想宿主。畢赤酵母生產的多種納米抗體藥物如ALX-0061、ALX-0171、Everestmab等已進入臨床階段。本研究利用Va、Vb和Vc三種納米抗體作為模式蛋白，探索通用型納米抗體高效表達技術。
首先，通過改變lox71的位置構建出能夠實現(xiàn)雙抗性基因敲除的親本質粒pLD。啟動子和信號肽的優(yōu)化使Va產量分別增加1.38倍和1.89倍。優(yōu)化基因劑量可使Va產量提高1.39倍。在野生型AOX1啟動子的控制下25種分子伴侶蛋白與Va共表達，其中HAC1使Va產量提高1.5倍。在此基礎上使用弱化的AOX1啟動子突變體55p對HAC1的表達強度進行微調，Va產量進一步增加2.41倍。最后通過高密度發(fā)酵Va產量達到2.13g/L，與初始菌株1-AOXα-Va的搖瓶表達產量相比提高49.8倍。將pLD-55p-HAC1質粒整合到GS115基因組中形成預整合HAC1分子伴侶的H55宿主，將多拷貝質粒轉化到該宿主后Vb和Vc產量分別增加1.98倍和2.34倍。無抗生素親本質粒的工程設計、表達元件的修飾、基因劑量的優(yōu)化以及H55宿主被組合成一種復合策略，為未來納米抗體的高效酵母表達鋪平道路。
無抗化畢赤酵母表達平臺是禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團隊的核心表達平臺之一，基于該平臺多種酶制劑的產量已達到10g/L以上水平。重組人膠原蛋白、塑料降解酶、KEX2、腸激酶、犬α干擾素、貓犬白蛋白及CSFVE2抗原、PCV3Cap抗原等重組蛋白亦借助該平臺實現(xiàn)高效表達。
碩士研究生鄭毅恒為論文第一作者，免疫所禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團隊李丁副研究員為論文通訊作者。該研究得到國家自然科學基金（32002316、31961133017）的資助。
文章鏈接：https://www.mdpi.com/2311-5637/10/1/37。
日期：2024-01-15
