一、簡介
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃±1℃條件下能生長。
銅綠假單胞菌在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在。對人有致病力，常引起人皮膚化膿感染，特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥，因此，在化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不得檢出銅綠假單胞菌。
二、參考標(biāo)準(zhǔn)
《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）
三、檢驗(yàn)流程
1.增菌培養(yǎng)
取樣品稀釋液加到SCDLP液體培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h。如有銅綠假單胞菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。結(jié)果如圖1所示：
a：空白對照；b：銅綠假單胞菌
圖1 SCDLP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果
2.分離培養(yǎng)
從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h。
銅綠假單胞菌生長過程中會產(chǎn)生兩種水溶性色素：黃色的熒光素和綠色的綠膿菌素，所以在溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上菌落呈黃綠色。銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。結(jié)果如圖2所示：
圖2 銅綠假單胞菌在溴化十六烷基三甲銨瓊脂上的培養(yǎng)結(jié)果
在缺乏溴化十六烷基三甲銨瓊脂時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種于平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。
銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基呈紅色，其他菌不生長。結(jié)果如圖3所示：
圖3 銅綠假單胞菌在乙酰胺培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果
3.染色鏡檢
挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，呈紅色桿狀。結(jié)果如圖4所示：
圖4 銅綠假單胞菌的革蘭氏染色結(jié)果
4.氧化酶試驗(yàn)
用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在氧化酶試紙上，在30s內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)紫色為陽性，2min內(nèi)不變色為陰性。銅綠假單胞菌在氧化酶試紙上顯藍(lán)色，為陽性。結(jié)果如圖5所示：
a：銅綠假單胞菌；b：大腸埃希氏菌
圖5 氧化酶試驗(yàn)結(jié)果
5.綠膿菌素試驗(yàn)
取可疑菌落2-3個，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，結(jié)果如圖6所示；向試管中加入氯仿3-5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍(lán)色時，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1 mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在，結(jié)果如圖7所示：
a：空白對照；b：大腸埃希氏菌；c：銅綠假單胞菌
圖6 綠膿菌素測定培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果
a：大腸埃希氏菌；b：銅綠假單胞菌
圖7 綠膿菌素試驗(yàn)結(jié)果
6.硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)
挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察結(jié)果。
銅綠假單胞菌在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻＝Y(jié)果如圖8所示：
a：空白對照；b：大腸埃希氏菌；c：銅綠假單胞菌
圖8 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)結(jié)果
7.明膠液化試驗(yàn)
取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10-30min，觀察結(jié)果。
呈溶解狀或表面溶解時即為明膠液化試驗(yàn)陽性；如凝固不溶者為陰性。銅綠假單胞菌呈溶解狀態(tài)，為陽性。結(jié)果如圖9所示：
a：空白對照；b：接菌培養(yǎng)后；c：銅綠假單胞菌4℃放置后；d：大腸埃希氏菌4℃放置后
圖9 明膠液化試驗(yàn)結(jié)果
8.42℃生長試驗(yàn)
挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于42℃±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h-48h。銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。結(jié)果如圖10所示：
a：空白對照；b：銅綠假單胞菌
圖10 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果
9.檢驗(yàn)結(jié)果報告
被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、42℃生長試驗(yàn)三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。
注：本文屬海博生物原創(chuàng)，未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。
