梨組織培養為梨優良品種的保存與改良、遺傳轉化體系建立、基因功能研究提供了有效途徑。本文綜述了國內外近年來梨組織培養研究現狀，重點對外植體類型、基礎培養基及其添加物、培養條件等因素對梨組織培養的影響進行概述。提出了現階段梨組織培養存在的問題及對策，以及在育種中的應用和前景展望，以期為今后的梨組培研究提供參考。
01
梨組織培養的外植體
植物組織培養技術起源于1902年德國植物學家哈伯蘭特提出的植物細胞具有全能性的概念。梨組織培養的研究始于20世紀30年代，70年代后關于梨及其砧木的組織培養的報道才逐漸增多，并且開始進行商業性生產。目前，梨的組織培養工作已經取得了不少成果，根據培養的目的不同而采用不同的外植體，國內外研究人員已對莖尖、莖段、葉片、子葉、花藥、原生質體等外植體成功進行了培養，其中葉片培養和莖尖培養的相關研究較多。
外植體選擇
梨樹的不同組織或器官都可作為外植體進行組織培養，但不同的外植體的再生能力不同，因此，選擇合適的外植體是組織培養成功的關鍵。
葉片是梨遺傳轉化中普遍采用的外植體。葉片再生方式有間接再生和直接再生，大多數梨品種的葉片再生方式是間接再生，即從葉片愈傷組織產生不定芽。最早于1988年，Laimer等用西洋梨康弗倫斯試管苗葉片誘導愈傷組織形成球狀結構，但是效果不佳，僅有少量球狀結構轉化成不定梢。隨后Abu-Qaoud等于1991年在改變氮源比例的條件下，證明了氮素對梨葉片外植體的不定芽再生是至關重要的。目前，國內學者對葉片組織培養的研究也獲得了一些成果，鐘穎等通過篩選不同生長調節劑質量濃度組合以及附加不同質量濃度的硝酸銀（AgNO3）建立了庫爾勒香梨的再生體系，愈傷組織誘導率為100%，不定芽形成率84.92%。王月等對梨矮化砧木青砧D3葉片進行了高效再生體系的構建，不定芽再生率達100%，根誘導率達100%。迄今為止，雪花梨、秋子梨、南果梨、蘋果梨、西洋梨紅星等均已建立葉片再生體系。
莖尖屬于分生組織，分裂最為活躍，幾乎不含病毒，莖尖培養的主要目的是脫除病毒和快速繁殖。梨病毒已報道的有20余種，發生較普遍的有蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）等。所以，實行苗木脫毒對果品生產具有重要意義。早在1979年Lane首次對梨的莖尖進行離體培養，并獲得了完整的植株。隨后國內學者趙惠祥于1982年以錦豐和早酥實生苗的莖尖為外植體培養獲得植株。苗冉冉等以津香蜜和巴梨的新梢為材料，建立了組培快繁體系，增殖系數達到5.73和3.83。王勝男等對京白梨的莖尖離體培養進行了研究，摸索出了最佳的增殖和生根培養基配方。到目前為止，莖尖培養已在黃冠梨、庫爾勒香梨、早酥、中香梨、南果梨等品種上獲得了成功。
莖段、芽等器官也可作為外植體進行組織培養。莖段培養可以分為有芽莖段培養和無芽莖段培養，相比于無芽莖段培養，有芽莖段培養更容易成功。孫清榮等以西洋梨紅茄的有芽莖段為外植體，進行腋芽誘導萌發，成功獲得了無菌苗。劉春等在對京白梨花芽進行離體培養時，發現1/2MS比MS更有利于愈傷組織的分化，但出芽率較低，并且篩選出了1.5mg/L GA3對花芽愈傷組織誘導具有積極作用，45d后分化出完整植株。
目前，梨組織培養主要以葉片和莖尖為外植體材料進行組織培養，通過不同培養途徑獲得再生植株。另外，也有部分研究通過培養子葉、花粉、胚、原生質體等得到了再生植株。通過比較，發現以器官直接誘導和誘導愈傷組織形成的再生植株，再生率較高。
外植體滅菌
外植體的消毒滅菌工作是植物組織培養技術中關鍵的一步。梨在生長過程中常年暴露在外界環境中，頂芽、莖和葉等器官容易附生或共生多種微生物。應用科學的滅菌方式能夠消滅外植體表面的細菌和真菌，在降低褐變率的同時，最大程度地減少外植體本身攜帶的污染保證成活率。
一般先將外植體用洗衣粉或洗潔精浸泡30min，再用流水沖洗1h以上，在超凈工作臺上采用75%乙醇（C2H5OH）消毒30s，無菌水沖洗3~5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒3~10min，無菌水沖洗3~5次；或者2%~5%次氯酸鈉（NaClO）消毒8~15min，無菌水沖洗5~6次，取出置于無菌吸水紙上吸去其表面多余水分。現有的研究結果表明，相比于次氯酸鈉，升汞的消毒效果較好。劉春等對京白梨芽采用2%次氯酸鈉和0.1%升汞溶液進行消毒處理，結果表明前者污染率為33%，后者污染率為18%。然而，由于升汞的劇毒性質，不利于試驗操作和廢液處理，對人體也有較大危害。Arab等對于G×N15（扁桃×桃雜交）砧木的研究表明，納米銀（NS）浸泡外植體或添加到培養基中均可減少內部、外部污染，也許不久后可以作為升汞的合適替代品。
02
梨組織培養的基礎培養基
及其添加物
培養基是決定植物組織培養能否成功的最關鍵因素，通常由基礎培養基添加植物生長調節劑和其他添加物構成。不同品種或同一品種不同的外植體，由于其基因型和外植體類型不同，其組培增殖能力、再生率和生長狀態等都存在顯著差異，適宜的培養基類型、植物生長調節劑的種類和濃度等也不盡相同。
基礎培養基
培養基是培養優良組培苗的基礎，篩選適宜不同品種及其外植體的培養基是組織培養研究的一項核心內容。培養基類型主要有液體培養基和固體培養基，在梨組織培養中一般以固體培養基為主，根據培養目的，又可細分為誘導（再生）培養基、增殖培養基和生根培養基3類。目前，梨組織培養中常用的基本培養基主要有MS、1/2MS、NN69、WPM、B5、QL等。
趙亞楠等采用交叉組合設計，從MS、1/2MS、WPM和NN69 4種培養基中，篩選出NN69是最適合杜梨組培苗生根的基礎培養基。盧明艷等以抗寒耐鹽堿梨砧木優系1-127為試材，證明WPM是其增殖和生根培養的最適培養基。孫清榮等通過比較紅星梨無菌苗在不同繼代培養基上的增殖生長，得出1/2MS培養基比MS、QL更有利于提高無菌苗的增殖效率。王勝男等通過摸索最適合京白梨增殖培養與生根培養的培養基，得出MS是最適宜的增殖培養基，1/2MS是最佳生根培養基；苗冉冉等在建立津香蜜和巴梨組培快繁體系時也得出了類似的結論。Lane等對日本砂梨品種的葉片進行離體培養，發現B5要比MS更有利于葉片再生；而秦璐等以庫爾勒香梨葉片為試材誘導不定芽再生，結果表明NN69相比于MS、B5具有更高的再生率。
以上研究結果說明，不同品種或同一品種不同的外植體，在不同培養階段適用的培養基類型有所差異。但MS是梨組織培養中常用的培養基類型且多用于繼代增殖培養，而1/2MS則更適合作為生根誘導培養基。NN69對梨葉片不定芽誘導的高效性已經被很多人證實，目前多用于作為梨再生試驗的基本培養基。
植物生長調節劑
植物生長調節劑種類及配比對梨的離體再生效果起著關鍵性的作用。有研究認為，培養基中生長調節劑的種類、濃度及配比不同造成組培材料生長和分化能力的不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異。目前，在梨組織培養中，主要應用的生長調節劑包括生長素類、細胞分裂素類以及赤霉素類等。
生長素類物質是梨組織培養中不定根誘導所必需的，常見的類型有：萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）4種。王金祥等已經證明，IAA是啟動不定根形成的重要因子，在根原基誘導階段起著至關重要的作用。相比于IAA，IBA更加穩定，可以刺激嫩葉和嫩芽形成的IAA運至基部，從而促進生根。NAA雖然不直接參與根的形成，但它可以促進組培苗中的淀粉水解為還原糖，有利于不定根的形成。生長素單一使用與混合使用對不同梨品種生根的作用是不同的。趙亞楠等通過篩選杜梨組培苗不定根原基誘導的激素配方，發現單獨使用1.0mg/L IBA的生根效果較好，但IBA和IAA各1.0mg/L混合處理時卻抑制了組培苗的生根，而使用IAA和NAA各1.0mg/L的組合時生根率和生根數達到最高，說明合適的生長素組合共同誘導杜梨組培苗生根效果優于單一生長素處理。2,4-D具有促進細胞分裂和生長的作用，常應用于愈傷組織誘導，但是在梨組織培養中應用較少，常用的生長素類物質是NAA、IAA和IBA 3種。
細胞分裂素常見的類型有芐氨基腺嘌呤（BA）、噻苯隆（TDZ）、玉米素（ZT）和激動素（KT）等。相比于TDZ，BA能誘導產生更多的腋芽，增殖效率更高，而TDZ比BA更有利于促進無菌苗葉片的伸展增大，更有利于壯苗生長。細胞分裂素通常與生長素一起使用，二者相輔相成，能夠達到更好的培養效果。王月等在研究不同濃度TDZ和IBA對青砧D3離體葉片不定芽再生的影響時，發現TDZ和IBA組合使用效果優于單獨使用，當3.0mg/L TDZ和0.3mg/L IBA組合時不定芽再生率和再生芽數均達最高，分別為100%和7.69個，而單獨使用TDZ時不定芽誘導率為86.67%。苗冉冉等也證明了BA和NAA的組合更適合津香蜜和巴梨的繼代增殖培養。ZT主要在梨體外器官發生細胞分化中起重要作用，但實際中不常用。然而在對其他植物的組培研究中，張虎等發現ZT對芫花莖段外植體上腋芽萌發的促進效果顯著優于BA；魏麗萍等證明了含KT的培養基誘導藥用植物山烏龜的不定芽效果優于TDZ。在梨組織培養中常用的細胞分裂素類物質是BA和TDZ。一般來說，生長素與細胞分裂素的比值較低，則有利于促進不定芽形成；生長素與細胞分裂素的比值較高，則有利于促進不定根的形成。不同的品種其最適宜的生長素和細胞分裂素的種類和濃度也各不相同。
赤霉素類（GAs）在木本植物組織培養的研究中應用較多的是GA3，其作用類似于生長素，但又有所區別。GA3對芽的增殖和伸長有一定的促進作用，但一般不單獨使用，通常與生長素和細胞分裂素組合使用能夠取得較好的效果。劉春等發現，在6-BA濃度不變的條件下，降低NAA濃度、提高GA3濃度或提高NAA濃度、降低GA3濃度均能促進梨組培苗的增殖。另外，在進行組織培養之前，對外植體進行一定濃度的GA3預處理是有利于生長的。陳麗靜等對南果梨莖尖進行0.1mg/L GA3預處理1周，其生長增殖率能達到84%，同時也發現GA3沒有促進根的生成反而起抑制作用。
多胺（Polyamines）是普遍存在于植物體內的另一種植物生長發育調節物質，以精胺、亞精胺、腐胺3種最為常見，一些多胺有利于生根和芽增殖，而另一些多胺則有利于胚胎發生、愈傷組織誘導和次生代謝產物的產生。閆帥等以杜梨繼代苗為材料，分別在生根誘導0、3、7、10、15d后，測定分析了基部莖段多胺類物質含量，結果表明亞精胺在杜梨不定根誘導和發生過程中起重要調節作用。崔寶明研究發現，外施72.6mg/L亞精胺可顯著提高玉米芽再生效率，但在梨上還未見多胺類生長調節劑對再生效果的報道。此外，油菜素內酯（Brassinolide）作為一種新型生長調節劑在植物組織培養中也有應用研究。張婭等在甘蔗組織培養研究中發現，油菜素內酯及其類似物對其不定根誘導和再生培養體系構建的促進效果明顯，在添加5mg/L油菜素內酯培養基上生長的材料有更強的生命力及更高的成活率，而梨上尚未見相關報道。
生長素、細胞分裂素和赤霉素是現階段梨組織培養中應用較為廣泛的生長調節劑，研究內容主要是以1種生長素搭配1種細胞分裂素的組成方式配比，在繼代培養中還需添加一定濃度的赤霉素以達到促進新梢生長的作用。關于多胺、油菜素內酯等生長調節劑在梨組織培養中應用的報道不多，研究內容較單一，沒有涉及與其他生長調節劑的互作關系，今后可考慮往這一方面進一步深入研究。
碳 源
碳源一般是糖類物質，是植物組織培養中滲透壓的調節物質及能量的主要來源，同時還可以調控與植物新陳代謝有關基因的表達來影響植株的生長發育。梨組織培養中常用的碳源物質有蔗糖、山梨醇、葡萄糖等，不同品種所適宜的碳源不盡相同。孫清榮等通過研究碳源對西洋梨品種紅星葉片不定梢再生能力的影響，發現d-山梨醇相比于蔗糖更有利于提高離體葉片不定梢再生率。因此，在植物組織培養工作中應當要考慮到適合該品種的碳源種類及濃度。
活性炭
活性炭（AC）具有吸附作用，在植物組織培養中，添加一定量的活性炭可吸附植物分泌的有害物質，同時可提供生根的暗環境，有利于根的誘導和根系生長，防止褐變，提高培養體內可溶性蛋白和總糖的含量。欒曉龍等通過分析不同的活性炭含量對秋子梨組培苗生長的影響，結果表明加入活性炭的組培苗在生根率、生根數、根長等方面均顯著高于對照組，并篩選出了最適宜秋子梨生根的培養基為1/2MS＋IBA（0.5mg/L）＋AC（1.0g/L），生根率達到了90%。
硝酸銀
在梨再生培養基中添加一定濃度的硝酸銀（AgNO3），可以有效提高葉片不定芽的再生率。鐘穎等通過建立庫爾勒香梨葉片再生體系，發現AgNO3濃度為0.5mg/L與TDZ和IBA組合，有利于庫爾勒香梨葉片愈傷組織誘導不定芽。另外，有研究表明，AgNO3通過競爭乙烯的作用位點抑制乙烯的合成及信號的傳導，能夠控制和逆轉組培苗的玻璃化現象。
納米硅
近年來，國內外學者對納米硅材料展開了深入研究，并且開始應用于植物組織培養領域。研究表明，在某些情況下納米硅通過參與植物自身組織或細胞器的構建，影響其生理活性物質的合成，從而調節生理代謝活動，同時影響植物的生長發育。Avestan等在瓊脂誘導滲透脅迫條件下，在培養基中添加50~100mg/L納米硅可以顯著提升蘋果外植體的增殖率，研究表明使用納米硅可以改善植物生長和對壓力的耐受性。崔云浩等以甜椒幼苗為材料，探究鹽脅迫下外源噴施納米硅對甜椒生長和生理特性的影響，結果表明納米硅通過調節甜椒植株體內抗氧化酶活性，降低植株氧化損傷，從而提高甜椒的耐鹽性。目前，納米硅在梨組織培養上應用的報道比較罕見，有待進一步研究。
03
梨組織培養的培養條件
光 照
光照條件對梨葉片不定芽發生和組培苗不定根誘導具有重要影響。發光二極管（LED）由于其低能耗、低熱輻射、特定波長輻照等特點，已逐漸取代熒光燈（FL）成為植物組織培養的常用光源。Lotfi等以梨組培苗為材料比較藍光、紅光和遠紅光LED光源對其增殖和生根的影響，結果表明藍光促進愈傷組織的重量增加，遠紅光有利于枝梢數量的增加但枝梢質量較差，紅光更有利于生根，生根率達到100%。另外，Dimitrova等發現，白光加藍光LED燈組合能夠顯著增加梨組培苗的株高。
通常條件下，外植體經過一定時間的暗培養可產生大量生長狀態良好、健壯的愈傷組織，這類愈傷組織易于繼代培養和不定芽、不定根誘導。王月等研究發現，青砧D3離體葉片接種后暗培養7d愈傷組織開始產生，暗培養14d移至光下培養（光照時間16h/d），4d后開始有不定芽的產生。趙亞楠等進行杜梨組培苗生根培養，采用混合光（紅∶藍∶白＝3∶1∶1），先暗培養7d后移至光照培養（光照時間14h/d，光照強度2000~2500lx），生根率達到了96%。
溫 度
在植物組織培養中，一般采取最適溫度并保持恒溫培養。梨組織培養中一般采用23~26℃的溫度進行培養，低于15℃培養的組織生長停滯，而高于35℃對生長不利。房洪舟等探討了不同溫度對刺梨愈傷組織增殖倍數的影響，結果表明愈傷組織增殖倍數在3個培養溫度（20、25、30℃）中表現出了較大的差異，其中25℃下培養的生長速度最快、增殖倍數最高。
pH值
pH值是植物組織培養過程中能否正常吸取營養物質的重要影響因素。另外，pH值能夠影響培養基的凝固程度，當pH值較低時培養基難以凝固，而較高時培養基比較堅硬不利于接種。梨組織培養中，pH值一般設置為5.8就能夠取得良好的效果。
04
梨組織培養中存在的問題
污 染
在梨組織培養中，污染表現可以分為真菌污染和細菌污染。真菌污染通常來源于空氣，孢子在適宜的環境中會迅速地增長，對組培設備、容器等造成污染，其明顯的特征在于產生面積較廣的菌落，同時還會形成多種顏色的絨毛狀菌斑，且帶有霉味；而細菌污染一般是由外植體內部與體表攜帶細菌引起的污染情況，病原菌大部分存儲在植物內部，通過一定的載體進行傳播，其特征主要以黏液狀物體、渾濁水跡狀以及泡沫發酵狀等多種形態表現，影響較為嚴重。
常采用的組培污染防治方法是在培養基中添加各種殺菌劑。盧明艷等以秋子梨污染組培苗為材料，研究山農一號殺菌劑對污染組培苗抑菌效果和生長的影響，結果表明，山農一號I型和III型殺菌劑配合使用對污染組培苗有顯著的抑菌效果，并且組培苗的恢復率在70%以上，增殖倍數在1~3倍。白一葦等利用含有25mg/L頭孢霉素＋30mg/L代森錳鋅與百菌清1∶1混合液的培養基，并在外植體插入培養基前利用100mg/L多菌靈藥液或100mg/L代森錳鋅與百菌清1∶1混合液進行浸潤包衣，可顯著降低組培材料被污染的風險，且對除愈傷組織以外的外植體的生長發育影響較弱。
除此之外，在進行組培前要科學合理地選擇外植體，選好外植體之后，對其進行細致清潔和消毒，接種前對設備消毒、人員衛生控制以及紫外燈照射消毒等措施也能夠減輕污染程度。
褐 化
梨外植體在組培過程中極易發生褐化，給梨無菌系的建立帶來了極大困難。褐化發生機制分為由多酚氧化酶作用于酚類物質引起的酶促褐化，以及由組培傷口、培養條件導致的脅迫褐化2種類型。
一般外植體中酚類物質含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季較弱，以后逐漸增強使褐變加重。有研究表明，適度的低溫對梨莖尖的酶促褐變有顯著的抑制作用，但是低溫處理會對外植體后期生長帶來不利影響，處理時間不宜過長。通過在培養基中加入活性炭、抗氧化劑等，褐變程度均顯著降低。另外，劉杰等發現，梨組培苗的多酚物質含量大大低于田間外植體材料。因此，在建立梨離體再生體系時，可以考慮以室內枝條水培催出的嫩芽為外植體進行接種。
05
梨組織培養在育種中的應用
由于梨的童期長、基因高度雜合、遺傳背景復雜，使得常規的育種周期長、成效低、工作量大。隨著近些年分子生物學的發展，遺傳轉化技術能夠通過定向引入外源基因，提高改良效果，加快育種進程，而高效的組織培養再生體系的建立則是基因轉移的前提條件。20世紀90年代隨著梨葉片再生體系相繼被報道，Mourgues等首次通過農桿菌介導法成功地將GUS及nptII基因導入西洋梨康弗倫斯，并獲得高達42.7%的遺傳轉化率。此后，梨的遺傳轉化普遍采用農桿菌介導法，即利用攜帶外源基因的農桿菌菌液侵染梨的外植體器官，然后對其進行再生培養，通過篩選后得到轉基因植株。目前，梨中導入的外源基因主要為抗病、乙烯調控及矮化基因，并且在西洋梨、白梨、砂梨、秋子梨、杜梨中均取得梨轉基因植株。
06
展 望
雖然前人在梨組織培養研究中取得了突破性進展，為梨無性系苗木繁育和遺傳轉化等研究奠定了堅實的基礎，但在組培過程中還存在外植體褐化嚴重、增殖系數低、生根誘導困難和再生率低等問題。因此，在今后的梨組織培養研究中，應從基因型選擇、基本培養基改良、不同植物生長調節劑的配比和培養方法創新等方面開展深入研究，以期有效解決上述問題，并將其更好地應用于梨無性系苗木的繁育和生物育種研究中。
聲 明：本文摘編自《中國果樹》2022年第5期“梨組織培養研究進展及其在育種中的應用”（葉宇，歐春青，王斐，張艷杰，馬力，楊冠宇，李佳純，姜淑苓）。
日期：2022-06-09
01
梨組織培養的外植體
植物組織培養技術起源于1902年德國植物學家哈伯蘭特提出的植物細胞具有全能性的概念。梨組織培養的研究始于20世紀30年代，70年代后關于梨及其砧木的組織培養的報道才逐漸增多，并且開始進行商業性生產。目前，梨的組織培養工作已經取得了不少成果，根據培養的目的不同而采用不同的外植體，國內外研究人員已對莖尖、莖段、葉片、子葉、花藥、原生質體等外植體成功進行了培養，其中葉片培養和莖尖培養的相關研究較多。
外植體選擇
梨樹的不同組織或器官都可作為外植體進行組織培養，但不同的外植體的再生能力不同，因此，選擇合適的外植體是組織培養成功的關鍵。
葉片是梨遺傳轉化中普遍采用的外植體。葉片再生方式有間接再生和直接再生，大多數梨品種的葉片再生方式是間接再生，即從葉片愈傷組織產生不定芽。最早于1988年，Laimer等用西洋梨康弗倫斯試管苗葉片誘導愈傷組織形成球狀結構，但是效果不佳，僅有少量球狀結構轉化成不定梢。隨后Abu-Qaoud等于1991年在改變氮源比例的條件下，證明了氮素對梨葉片外植體的不定芽再生是至關重要的。目前，國內學者對葉片組織培養的研究也獲得了一些成果，鐘穎等通過篩選不同生長調節劑質量濃度組合以及附加不同質量濃度的硝酸銀（AgNO3）建立了庫爾勒香梨的再生體系，愈傷組織誘導率為100%，不定芽形成率84.92%。王月等對梨矮化砧木青砧D3葉片進行了高效再生體系的構建，不定芽再生率達100%，根誘導率達100%。迄今為止，雪花梨、秋子梨、南果梨、蘋果梨、西洋梨紅星等均已建立葉片再生體系。
莖尖屬于分生組織，分裂最為活躍，幾乎不含病毒，莖尖培養的主要目的是脫除病毒和快速繁殖。梨病毒已報道的有20余種，發生較普遍的有蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）等。所以，實行苗木脫毒對果品生產具有重要意義。早在1979年Lane首次對梨的莖尖進行離體培養，并獲得了完整的植株。隨后國內學者趙惠祥于1982年以錦豐和早酥實生苗的莖尖為外植體培養獲得植株。苗冉冉等以津香蜜和巴梨的新梢為材料，建立了組培快繁體系，增殖系數達到5.73和3.83。王勝男等對京白梨的莖尖離體培養進行了研究，摸索出了最佳的增殖和生根培養基配方。到目前為止，莖尖培養已在黃冠梨、庫爾勒香梨、早酥、中香梨、南果梨等品種上獲得了成功。
莖段、芽等器官也可作為外植體進行組織培養。莖段培養可以分為有芽莖段培養和無芽莖段培養，相比于無芽莖段培養，有芽莖段培養更容易成功。孫清榮等以西洋梨紅茄的有芽莖段為外植體，進行腋芽誘導萌發，成功獲得了無菌苗。劉春等在對京白梨花芽進行離體培養時，發現1/2MS比MS更有利于愈傷組織的分化，但出芽率較低，并且篩選出了1.5mg/L GA3對花芽愈傷組織誘導具有積極作用，45d后分化出完整植株。
目前，梨組織培養主要以葉片和莖尖為外植體材料進行組織培養，通過不同培養途徑獲得再生植株。另外，也有部分研究通過培養子葉、花粉、胚、原生質體等得到了再生植株。通過比較，發現以器官直接誘導和誘導愈傷組織形成的再生植株，再生率較高。
外植體滅菌
外植體的消毒滅菌工作是植物組織培養技術中關鍵的一步。梨在生長過程中常年暴露在外界環境中，頂芽、莖和葉等器官容易附生或共生多種微生物。應用科學的滅菌方式能夠消滅外植體表面的細菌和真菌，在降低褐變率的同時，最大程度地減少外植體本身攜帶的污染保證成活率。
一般先將外植體用洗衣粉或洗潔精浸泡30min，再用流水沖洗1h以上，在超凈工作臺上采用75%乙醇（C2H5OH）消毒30s，無菌水沖洗3~5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒3~10min，無菌水沖洗3~5次；或者2%~5%次氯酸鈉（NaClO）消毒8~15min，無菌水沖洗5~6次，取出置于無菌吸水紙上吸去其表面多余水分。現有的研究結果表明，相比于次氯酸鈉，升汞的消毒效果較好。劉春等對京白梨芽采用2%次氯酸鈉和0.1%升汞溶液進行消毒處理，結果表明前者污染率為33%，后者污染率為18%。然而，由于升汞的劇毒性質，不利于試驗操作和廢液處理，對人體也有較大危害。Arab等對于G×N15（扁桃×桃雜交）砧木的研究表明，納米銀（NS）浸泡外植體或添加到培養基中均可減少內部、外部污染，也許不久后可以作為升汞的合適替代品。
02
梨組織培養的基礎培養基
及其添加物
培養基是決定植物組織培養能否成功的最關鍵因素，通常由基礎培養基添加植物生長調節劑和其他添加物構成。不同品種或同一品種不同的外植體，由于其基因型和外植體類型不同，其組培增殖能力、再生率和生長狀態等都存在顯著差異，適宜的培養基類型、植物生長調節劑的種類和濃度等也不盡相同。
基礎培養基
培養基是培養優良組培苗的基礎，篩選適宜不同品種及其外植體的培養基是組織培養研究的一項核心內容。培養基類型主要有液體培養基和固體培養基，在梨組織培養中一般以固體培養基為主，根據培養目的，又可細分為誘導（再生）培養基、增殖培養基和生根培養基3類。目前，梨組織培養中常用的基本培養基主要有MS、1/2MS、NN69、WPM、B5、QL等。
趙亞楠等采用交叉組合設計，從MS、1/2MS、WPM和NN69 4種培養基中，篩選出NN69是最適合杜梨組培苗生根的基礎培養基。盧明艷等以抗寒耐鹽堿梨砧木優系1-127為試材，證明WPM是其增殖和生根培養的最適培養基。孫清榮等通過比較紅星梨無菌苗在不同繼代培養基上的增殖生長，得出1/2MS培養基比MS、QL更有利于提高無菌苗的增殖效率。王勝男等通過摸索最適合京白梨增殖培養與生根培養的培養基，得出MS是最適宜的增殖培養基，1/2MS是最佳生根培養基；苗冉冉等在建立津香蜜和巴梨組培快繁體系時也得出了類似的結論。Lane等對日本砂梨品種的葉片進行離體培養，發現B5要比MS更有利于葉片再生；而秦璐等以庫爾勒香梨葉片為試材誘導不定芽再生，結果表明NN69相比于MS、B5具有更高的再生率。
以上研究結果說明，不同品種或同一品種不同的外植體，在不同培養階段適用的培養基類型有所差異。但MS是梨組織培養中常用的培養基類型且多用于繼代增殖培養，而1/2MS則更適合作為生根誘導培養基。NN69對梨葉片不定芽誘導的高效性已經被很多人證實，目前多用于作為梨再生試驗的基本培養基。
植物生長調節劑
植物生長調節劑種類及配比對梨的離體再生效果起著關鍵性的作用。有研究認為，培養基中生長調節劑的種類、濃度及配比不同造成組培材料生長和分化能力的不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異。目前，在梨組織培養中，主要應用的生長調節劑包括生長素類、細胞分裂素類以及赤霉素類等。
生長素類物質是梨組織培養中不定根誘導所必需的，常見的類型有：萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）4種。王金祥等已經證明，IAA是啟動不定根形成的重要因子，在根原基誘導階段起著至關重要的作用。相比于IAA，IBA更加穩定，可以刺激嫩葉和嫩芽形成的IAA運至基部，從而促進生根。NAA雖然不直接參與根的形成，但它可以促進組培苗中的淀粉水解為還原糖，有利于不定根的形成。生長素單一使用與混合使用對不同梨品種生根的作用是不同的。趙亞楠等通過篩選杜梨組培苗不定根原基誘導的激素配方，發現單獨使用1.0mg/L IBA的生根效果較好，但IBA和IAA各1.0mg/L混合處理時卻抑制了組培苗的生根，而使用IAA和NAA各1.0mg/L的組合時生根率和生根數達到最高，說明合適的生長素組合共同誘導杜梨組培苗生根效果優于單一生長素處理。2,4-D具有促進細胞分裂和生長的作用，常應用于愈傷組織誘導，但是在梨組織培養中應用較少，常用的生長素類物質是NAA、IAA和IBA 3種。
細胞分裂素常見的類型有芐氨基腺嘌呤（BA）、噻苯隆（TDZ）、玉米素（ZT）和激動素（KT）等。相比于TDZ，BA能誘導產生更多的腋芽，增殖效率更高，而TDZ比BA更有利于促進無菌苗葉片的伸展增大，更有利于壯苗生長。細胞分裂素通常與生長素一起使用，二者相輔相成，能夠達到更好的培養效果。王月等在研究不同濃度TDZ和IBA對青砧D3離體葉片不定芽再生的影響時，發現TDZ和IBA組合使用效果優于單獨使用，當3.0mg/L TDZ和0.3mg/L IBA組合時不定芽再生率和再生芽數均達最高，分別為100%和7.69個，而單獨使用TDZ時不定芽誘導率為86.67%。苗冉冉等也證明了BA和NAA的組合更適合津香蜜和巴梨的繼代增殖培養。ZT主要在梨體外器官發生細胞分化中起重要作用，但實際中不常用。然而在對其他植物的組培研究中，張虎等發現ZT對芫花莖段外植體上腋芽萌發的促進效果顯著優于BA；魏麗萍等證明了含KT的培養基誘導藥用植物山烏龜的不定芽效果優于TDZ。在梨組織培養中常用的細胞分裂素類物質是BA和TDZ。一般來說，生長素與細胞分裂素的比值較低，則有利于促進不定芽形成；生長素與細胞分裂素的比值較高，則有利于促進不定根的形成。不同的品種其最適宜的生長素和細胞分裂素的種類和濃度也各不相同。
赤霉素類（GAs）在木本植物組織培養的研究中應用較多的是GA3，其作用類似于生長素，但又有所區別。GA3對芽的增殖和伸長有一定的促進作用，但一般不單獨使用，通常與生長素和細胞分裂素組合使用能夠取得較好的效果。劉春等發現，在6-BA濃度不變的條件下，降低NAA濃度、提高GA3濃度或提高NAA濃度、降低GA3濃度均能促進梨組培苗的增殖。另外，在進行組織培養之前，對外植體進行一定濃度的GA3預處理是有利于生長的。陳麗靜等對南果梨莖尖進行0.1mg/L GA3預處理1周，其生長增殖率能達到84%，同時也發現GA3沒有促進根的生成反而起抑制作用。
多胺（Polyamines）是普遍存在于植物體內的另一種植物生長發育調節物質，以精胺、亞精胺、腐胺3種最為常見，一些多胺有利于生根和芽增殖，而另一些多胺則有利于胚胎發生、愈傷組織誘導和次生代謝產物的產生。閆帥等以杜梨繼代苗為材料，分別在生根誘導0、3、7、10、15d后，測定分析了基部莖段多胺類物質含量，結果表明亞精胺在杜梨不定根誘導和發生過程中起重要調節作用。崔寶明研究發現，外施72.6mg/L亞精胺可顯著提高玉米芽再生效率，但在梨上還未見多胺類生長調節劑對再生效果的報道。此外，油菜素內酯（Brassinolide）作為一種新型生長調節劑在植物組織培養中也有應用研究。張婭等在甘蔗組織培養研究中發現，油菜素內酯及其類似物對其不定根誘導和再生培養體系構建的促進效果明顯，在添加5mg/L油菜素內酯培養基上生長的材料有更強的生命力及更高的成活率，而梨上尚未見相關報道。
生長素、細胞分裂素和赤霉素是現階段梨組織培養中應用較為廣泛的生長調節劑，研究內容主要是以1種生長素搭配1種細胞分裂素的組成方式配比，在繼代培養中還需添加一定濃度的赤霉素以達到促進新梢生長的作用。關于多胺、油菜素內酯等生長調節劑在梨組織培養中應用的報道不多，研究內容較單一，沒有涉及與其他生長調節劑的互作關系，今后可考慮往這一方面進一步深入研究。
碳 源
碳源一般是糖類物質，是植物組織培養中滲透壓的調節物質及能量的主要來源，同時還可以調控與植物新陳代謝有關基因的表達來影響植株的生長發育。梨組織培養中常用的碳源物質有蔗糖、山梨醇、葡萄糖等，不同品種所適宜的碳源不盡相同。孫清榮等通過研究碳源對西洋梨品種紅星葉片不定梢再生能力的影響，發現d-山梨醇相比于蔗糖更有利于提高離體葉片不定梢再生率。因此，在植物組織培養工作中應當要考慮到適合該品種的碳源種類及濃度。
活性炭
活性炭（AC）具有吸附作用，在植物組織培養中，添加一定量的活性炭可吸附植物分泌的有害物質，同時可提供生根的暗環境，有利于根的誘導和根系生長，防止褐變，提高培養體內可溶性蛋白和總糖的含量。欒曉龍等通過分析不同的活性炭含量對秋子梨組培苗生長的影響，結果表明加入活性炭的組培苗在生根率、生根數、根長等方面均顯著高于對照組，并篩選出了最適宜秋子梨生根的培養基為1/2MS＋IBA（0.5mg/L）＋AC（1.0g/L），生根率達到了90%。
硝酸銀
在梨再生培養基中添加一定濃度的硝酸銀（AgNO3），可以有效提高葉片不定芽的再生率。鐘穎等通過建立庫爾勒香梨葉片再生體系，發現AgNO3濃度為0.5mg/L與TDZ和IBA組合，有利于庫爾勒香梨葉片愈傷組織誘導不定芽。另外，有研究表明，AgNO3通過競爭乙烯的作用位點抑制乙烯的合成及信號的傳導，能夠控制和逆轉組培苗的玻璃化現象。
納米硅
近年來，國內外學者對納米硅材料展開了深入研究，并且開始應用于植物組織培養領域。研究表明，在某些情況下納米硅通過參與植物自身組織或細胞器的構建，影響其生理活性物質的合成，從而調節生理代謝活動，同時影響植物的生長發育。Avestan等在瓊脂誘導滲透脅迫條件下，在培養基中添加50~100mg/L納米硅可以顯著提升蘋果外植體的增殖率，研究表明使用納米硅可以改善植物生長和對壓力的耐受性。崔云浩等以甜椒幼苗為材料，探究鹽脅迫下外源噴施納米硅對甜椒生長和生理特性的影響，結果表明納米硅通過調節甜椒植株體內抗氧化酶活性，降低植株氧化損傷，從而提高甜椒的耐鹽性。目前，納米硅在梨組織培養上應用的報道比較罕見，有待進一步研究。
03
梨組織培養的培養條件
光 照
光照條件對梨葉片不定芽發生和組培苗不定根誘導具有重要影響。發光二極管（LED）由于其低能耗、低熱輻射、特定波長輻照等特點，已逐漸取代熒光燈（FL）成為植物組織培養的常用光源。Lotfi等以梨組培苗為材料比較藍光、紅光和遠紅光LED光源對其增殖和生根的影響，結果表明藍光促進愈傷組織的重量增加，遠紅光有利于枝梢數量的增加但枝梢質量較差，紅光更有利于生根，生根率達到100%。另外，Dimitrova等發現，白光加藍光LED燈組合能夠顯著增加梨組培苗的株高。
通常條件下，外植體經過一定時間的暗培養可產生大量生長狀態良好、健壯的愈傷組織，這類愈傷組織易于繼代培養和不定芽、不定根誘導。王月等研究發現，青砧D3離體葉片接種后暗培養7d愈傷組織開始產生，暗培養14d移至光下培養（光照時間16h/d），4d后開始有不定芽的產生。趙亞楠等進行杜梨組培苗生根培養，采用混合光（紅∶藍∶白＝3∶1∶1），先暗培養7d后移至光照培養（光照時間14h/d，光照強度2000~2500lx），生根率達到了96%。
溫 度
在植物組織培養中，一般采取最適溫度并保持恒溫培養。梨組織培養中一般采用23~26℃的溫度進行培養，低于15℃培養的組織生長停滯，而高于35℃對生長不利。房洪舟等探討了不同溫度對刺梨愈傷組織增殖倍數的影響，結果表明愈傷組織增殖倍數在3個培養溫度（20、25、30℃）中表現出了較大的差異，其中25℃下培養的生長速度最快、增殖倍數最高。
pH值
pH值是植物組織培養過程中能否正常吸取營養物質的重要影響因素。另外，pH值能夠影響培養基的凝固程度，當pH值較低時培養基難以凝固，而較高時培養基比較堅硬不利于接種。梨組織培養中，pH值一般設置為5.8就能夠取得良好的效果。
04
梨組織培養中存在的問題
污 染
在梨組織培養中，污染表現可以分為真菌污染和細菌污染。真菌污染通常來源于空氣，孢子在適宜的環境中會迅速地增長，對組培設備、容器等造成污染，其明顯的特征在于產生面積較廣的菌落，同時還會形成多種顏色的絨毛狀菌斑，且帶有霉味；而細菌污染一般是由外植體內部與體表攜帶細菌引起的污染情況，病原菌大部分存儲在植物內部，通過一定的載體進行傳播，其特征主要以黏液狀物體、渾濁水跡狀以及泡沫發酵狀等多種形態表現，影響較為嚴重。
常采用的組培污染防治方法是在培養基中添加各種殺菌劑。盧明艷等以秋子梨污染組培苗為材料，研究山農一號殺菌劑對污染組培苗抑菌效果和生長的影響，結果表明，山農一號I型和III型殺菌劑配合使用對污染組培苗有顯著的抑菌效果，并且組培苗的恢復率在70%以上，增殖倍數在1~3倍。白一葦等利用含有25mg/L頭孢霉素＋30mg/L代森錳鋅與百菌清1∶1混合液的培養基，并在外植體插入培養基前利用100mg/L多菌靈藥液或100mg/L代森錳鋅與百菌清1∶1混合液進行浸潤包衣，可顯著降低組培材料被污染的風險，且對除愈傷組織以外的外植體的生長發育影響較弱。
除此之外，在進行組培前要科學合理地選擇外植體，選好外植體之后，對其進行細致清潔和消毒，接種前對設備消毒、人員衛生控制以及紫外燈照射消毒等措施也能夠減輕污染程度。
褐 化
梨外植體在組培過程中極易發生褐化，給梨無菌系的建立帶來了極大困難。褐化發生機制分為由多酚氧化酶作用于酚類物質引起的酶促褐化，以及由組培傷口、培養條件導致的脅迫褐化2種類型。
一般外植體中酚類物質含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季較弱，以后逐漸增強使褐變加重。有研究表明，適度的低溫對梨莖尖的酶促褐變有顯著的抑制作用，但是低溫處理會對外植體后期生長帶來不利影響，處理時間不宜過長。通過在培養基中加入活性炭、抗氧化劑等，褐變程度均顯著降低。另外，劉杰等發現，梨組培苗的多酚物質含量大大低于田間外植體材料。因此，在建立梨離體再生體系時，可以考慮以室內枝條水培催出的嫩芽為外植體進行接種。
05
梨組織培養在育種中的應用
由于梨的童期長、基因高度雜合、遺傳背景復雜，使得常規的育種周期長、成效低、工作量大。隨著近些年分子生物學的發展，遺傳轉化技術能夠通過定向引入外源基因，提高改良效果，加快育種進程，而高效的組織培養再生體系的建立則是基因轉移的前提條件。20世紀90年代隨著梨葉片再生體系相繼被報道，Mourgues等首次通過農桿菌介導法成功地將GUS及nptII基因導入西洋梨康弗倫斯，并獲得高達42.7%的遺傳轉化率。此后，梨的遺傳轉化普遍采用農桿菌介導法，即利用攜帶外源基因的農桿菌菌液侵染梨的外植體器官，然后對其進行再生培養，通過篩選后得到轉基因植株。目前，梨中導入的外源基因主要為抗病、乙烯調控及矮化基因，并且在西洋梨、白梨、砂梨、秋子梨、杜梨中均取得梨轉基因植株。
06
展 望
雖然前人在梨組織培養研究中取得了突破性進展，為梨無性系苗木繁育和遺傳轉化等研究奠定了堅實的基礎，但在組培過程中還存在外植體褐化嚴重、增殖系數低、生根誘導困難和再生率低等問題。因此，在今后的梨組織培養研究中，應從基因型選擇、基本培養基改良、不同植物生長調節劑的配比和培養方法創新等方面開展深入研究，以期有效解決上述問題，并將其更好地應用于梨無性系苗木的繁育和生物育種研究中。
聲 明：本文摘編自《中國果樹》2022年第5期“梨組織培養研究進展及其在育種中的應用”（葉宇，歐春青，王斐，張艷杰，馬力，楊冠宇，李佳純，姜淑苓）。
日期：2022-06-09
