近日，中國農科院植保所抗病蟲作物生態安全評價與利用創新團隊在植物生物學領域的國際著名期刊《植物細胞》（The Plant Cell）上在線發表了題為“Efficient in situ epitope tagging of rice genes by nuclease-mediated prime editing”的研究論文，該研究借用基于CRISPR/Cas核酸酶的引導編輯系統，通過微同源介導末端連接途徑實現了水稻多個內源基因的高效精準標記，為水稻內源基因標簽研究提供了全新的編輯策略。
標簽蛋白便利于科學家研究蛋白質的互作關系、信號通路和分子機制，被廣泛應用于生命科學領域的分子生物學、細胞生物學和生物化學研究中。相對于傳統轉基因技術介導的外源標簽蛋白研究，其過量表達有時會造成研究結果的不可靠性，通過基因編輯技術直接標簽內源靶基因創制材料，研究結果更能反映靶基因在細胞內參與的生理生化過程和實際功能。長期以來，如何突破高效的植物內源基因標簽技術一直都是生物技術研究人員關注的重要課題。
在該研究中，研究人員首先借助多種優化策略在水稻上建立了高效的引導編輯系統，測試靶位點的編輯效率高達95.83%。進一步探索了基于CRISPR/Cas核酸酶的引導編輯系統，通過不同DNA修復途徑（非同源介導的末端連接/NHEJ和微同源介導的末端連接/MMEJ）在水稻內源基因精準標記中的潛力。
結果表明兩種策略均能實現水稻內源基因的精準FLAG標記，但MMEJ介導的 NM-PE策略在精準性和效率上比NHEJ介導的 NN-PE策略更優。此外，借助的SpRY和ScCas9核酸酶，松弛型的引導編輯器通過NM-PE策略成功實現內源基因OsMPK3、OsMPK6、OsMPK7、OsMPK10、OsMPK11的精準標記，編輯效率高達70.83%，大大擴展了NM-PE標簽策略在水稻基因組中的應用范圍。最后，研究人員探索了NM-PE在水稻內源雙基因標簽中的潛力，結果表明后代基因編輯群體擁有大量單、雙基因精準標簽植株以及基因敲除植株。綜上，基于CRISPR/Cas核酸酶介導的雙鏈DNA切割和微同源介導的末端連接途徑的NM-PE策略，可以實現水稻靶基因的多核苷酸精準操作、精準標簽及敲除等，在未來水稻蛋白標記組學研究、基因功能研究和遺傳改良方面具有很大的潛力，也為其它農作物和經濟作物相關研究提供的全新的思路。
中國農業科學院植物保護研究所博士研究生李雪琪（海南專項）和博士研究生張素杰為本文共同第一作者，周煥斌研究員為通訊作者，團隊多名成員共同合作完成，北京農林科學院李少芳研究員、挪威生物經濟研究所Carl Spetz研究員、青島農業大學黃金光教授、中國農科院植保所周雪平教授也參與了相關研究工作。該研究得到了農業生物育種重大專項、國家重點研發計劃、中國農業科學院南繁專項基金、海南省種業重點實驗室和中國農業科學院創新工程等項目的支持。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae316
日期：2024-12-17
標簽蛋白便利于科學家研究蛋白質的互作關系、信號通路和分子機制，被廣泛應用于生命科學領域的分子生物學、細胞生物學和生物化學研究中。相對于傳統轉基因技術介導的外源標簽蛋白研究，其過量表達有時會造成研究結果的不可靠性，通過基因編輯技術直接標簽內源靶基因創制材料，研究結果更能反映靶基因在細胞內參與的生理生化過程和實際功能。長期以來，如何突破高效的植物內源基因標簽技術一直都是生物技術研究人員關注的重要課題。
在該研究中，研究人員首先借助多種優化策略在水稻上建立了高效的引導編輯系統，測試靶位點的編輯效率高達95.83%。進一步探索了基于CRISPR/Cas核酸酶的引導編輯系統，通過不同DNA修復途徑（非同源介導的末端連接/NHEJ和微同源介導的末端連接/MMEJ）在水稻內源基因精準標記中的潛力。
結果表明兩種策略均能實現水稻內源基因的精準FLAG標記，但MMEJ介導的 NM-PE策略在精準性和效率上比NHEJ介導的 NN-PE策略更優。此外，借助的SpRY和ScCas9核酸酶，松弛型的引導編輯器通過NM-PE策略成功實現內源基因OsMPK3、OsMPK6、OsMPK7、OsMPK10、OsMPK11的精準標記，編輯效率高達70.83%，大大擴展了NM-PE標簽策略在水稻基因組中的應用范圍。最后，研究人員探索了NM-PE在水稻內源雙基因標簽中的潛力，結果表明后代基因編輯群體擁有大量單、雙基因精準標簽植株以及基因敲除植株。綜上，基于CRISPR/Cas核酸酶介導的雙鏈DNA切割和微同源介導的末端連接途徑的NM-PE策略，可以實現水稻靶基因的多核苷酸精準操作、精準標簽及敲除等，在未來水稻蛋白標記組學研究、基因功能研究和遺傳改良方面具有很大的潛力，也為其它農作物和經濟作物相關研究提供的全新的思路。
中國農業科學院植物保護研究所博士研究生李雪琪（海南專項）和博士研究生張素杰為本文共同第一作者，周煥斌研究員為通訊作者，團隊多名成員共同合作完成，北京農林科學院李少芳研究員、挪威生物經濟研究所Carl Spetz研究員、青島農業大學黃金光教授、中國農科院植保所周雪平教授也參與了相關研究工作。該研究得到了農業生物育種重大專項、國家重點研發計劃、中國農業科學院南繁專項基金、海南省種業重點實驗室和中國農業科學院創新工程等項目的支持。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae316
日期：2024-12-17
