白粉病是葫蘆科作物的三大主要病害之一。設施栽培中的高溫高濕環境很容易誘導白粉病的爆發，嚴重影響黃瓜產量和品質。目前，黃瓜白粉病的防治主要依賴化學藥劑，然而在一個生長季內需多次施藥，對以鮮食為主的黃瓜而言，因農藥殘留導致的食品安全隱患不容小覷。黃瓜白粉病抗性是由多基因位點控制的數量性狀，傳統育種技術很難高效整合多個抗病基因而不引入連鎖累贅。利用CRISPR/Cas多基因編輯技術同時敲除多個隱性抗病基因創制黃瓜白粉病抗性種質，是黃瓜白粉病防治的新策略，具有重要的經濟意義。
近日，華中農業大學別之龍教授/楊麗副教授團隊在Plant Physiology在線發表了題為“Systemicanalysis of cucumber MLO family by multiplex gene editing for engineeringpowdery mildew resistance”的研究論文。在瓜類作物中首次建立高效的多基因編輯體系，利用該體系靶向敲除黃瓜CsMLO基因家族13個成員，成功獲得白粉病完全抗性黃瓜種質材料，并通過多組學聯合分析解析了鈣信號參與Csmlo1/8/11介導的黃瓜白粉病抗性分子機制。
黃瓜白粉病抗性基因的研究最早可追溯到1940年代（He et al., 2013）。根據多年來研究人員對不同遺傳群體的黃瓜白粉病抗性基因定位研究，翁益群課題組總結歸納了19個共識性QTL位點（Wang etal., 2020）。然而，其中僅有pm5.3位點成功克隆到抗性基因，突顯了黃瓜白粉病抗性遺傳機制的復雜性。該基因Mildewresistance Locus o 8（CsMLO8）由蔡潤和白玉玲課題同時報道（Berget al., 2015; Nie et al., 2015），在抗性材料中由于轉座子插入等原因，CsMLO8功能失活導致了隱性白粉病抗性。然而，進一步研究發現，盡管Csmlo8功能缺失突變在許多黃瓜抗性種質中普遍存在，但也觀察到部分種質具有Csmlo8突變卻表現為白粉病易感的現象。這表明還存在其他抗病位點與Csmlo8共同介導白粉病抗性，黃瓜白粉病抗性的遺傳基礎仍然有待深入挖掘。CsMLO基因家族成員之間存在功能冗余性，前人的正向遺傳學研究結果也發現多個白粉病抗病QTL位點中存在CsMLO家族的其他基因，暗示了其他CsMLO成員與CsMLO8基因共同調控黃瓜白粉病抗性的可能性。因此，對CsMLO基因家族進行系統功能分析將為黃瓜抗病分子育種提供理論基礎。
該研究首先采用II型啟動子cestrum yellowleaf curling virus （CmYLCV） 驅動由tRNAGly 間隔串聯的多個sgRNA，建立了一個高效的黃瓜多基因編輯系統。利用該系統，以易感白粉病的華南型黃瓜CU2種質為受體，對CsMLO基因家族13個成員進行了多基因編輯，獲得了一系列Csmlo單、多突變體。進一步，對這些突變體的白粉病抗性和生長表型進行了系統調查。研究發現敲除CsMLO家族第V分支三個基因CsMLO1/8/11，所得單突變體Csmlo8仍然易感白粉病，所得雙突變體表現為中等白粉病抗性，尤其值得關注的是同時編輯這三個基因的黃瓜三突變體材料Csmlo1/8/11獲得了白粉病完全抗性。然而，并未觀察到五突變體Csmlo3/4/5/9/10白粉病抗性的改變。此外，對多個Csmlo突變體生長表型進行系統觀察還發現，相較于對照為五瓣花和三心室果實，Csmlo3/10突變體中黃瓜六瓣花、七瓣花的數目顯著增多，其四心室果實的比例也大幅提高。這是首次在植物中報道CsMLO家族Ⅱ分支成員的功能。而Csmlo12/13突變則導致雄性不育且葉面積增大的表型。因此，通過對CsMLO家族基因進行多基因編輯，成功獲得了白粉病完全抗性黃瓜材料；對家族突變體白粉病抗性和生長發育表型的系統調查，為利用Csmlo進行黃瓜白粉病抗性育種提供了重要的理論依據。
研究人員進一步基于所得不同抗病程度Csmlo突變體，采用高通量轉錄組與蛋白組關聯分析，發現鈣信號在Csmlo1/8/11介導的白粉病抗性中發揮著重要的調控作用。在Csmlo1/8/11突變體中，鈣信號下游的三個基因CsKIC、CsCML28和CsCPK11的蛋白表達量顯著升高。進一步研究發現，CsKIC與第V分支成員CsMLO1/8/11均存在蛋白互作。通過VIGS瞬時沉默CsKIC，能增強黃瓜白粉病抗病性，這表明與CsMLO8的功能一致，CsKIC是白粉病抗性的負調控因子，猜測CsKIC與CsMLO1/8/11互作協同參與白粉病菌入侵過程。另外，通過VIGS瞬時沉默CsCML28和CsCPK11，觀察到黃瓜白粉病感病性增加；且二者分別與CsMLO1/8共沉默時，部分恢復了由于CsMLO1/8敲低而導致的白粉病抗性。這表明CsCML28和CsCPK11可能在CsMLO1/8的下游發揮正向調控作用，參與介導黃瓜白粉病抗性。最后，通過穩定遺傳轉化得到了CsCPK11過表達植株，與對照相比，其白粉病抗性顯著增強。這些發現為深入理解Csmlo介導的黃瓜白粉病抗性機制提供了關鍵線索。
綜上所述，該研究為瓜類作物生物育種提供了高效的多基因編輯工具，為黃瓜白粉病抗性育種提供了寶貴的基因和種質資源。該研究深入解析鈣信號參與Csmlo1/8/11介導的白粉病抗性分子機制，也為豐富白粉病抗病調控模型提供了新的理論依據。
華中農業大學園藝林學學院別之龍教授和楊麗副教授為本文共同通訊作者，在讀博士生馬明茹和楊麗副教授為第一作者。西北農林科技大學李大偉副教授和華中農業大學孔秋生教授參與了本項研究。本研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、湖北省自然科學基金創新群體和湖北省重點研發項目等課題資助。
日期：2024-02-26
近日，華中農業大學別之龍教授/楊麗副教授團隊在Plant Physiology在線發表了題為“Systemicanalysis of cucumber MLO family by multiplex gene editing for engineeringpowdery mildew resistance”的研究論文。在瓜類作物中首次建立高效的多基因編輯體系，利用該體系靶向敲除黃瓜CsMLO基因家族13個成員，成功獲得白粉病完全抗性黃瓜種質材料，并通過多組學聯合分析解析了鈣信號參與Csmlo1/8/11介導的黃瓜白粉病抗性分子機制。
黃瓜白粉病抗性基因的研究最早可追溯到1940年代（He et al., 2013）。根據多年來研究人員對不同遺傳群體的黃瓜白粉病抗性基因定位研究，翁益群課題組總結歸納了19個共識性QTL位點（Wang etal., 2020）。然而，其中僅有pm5.3位點成功克隆到抗性基因，突顯了黃瓜白粉病抗性遺傳機制的復雜性。該基因Mildewresistance Locus o 8（CsMLO8）由蔡潤和白玉玲課題同時報道（Berget al., 2015; Nie et al., 2015），在抗性材料中由于轉座子插入等原因，CsMLO8功能失活導致了隱性白粉病抗性。然而，進一步研究發現，盡管Csmlo8功能缺失突變在許多黃瓜抗性種質中普遍存在，但也觀察到部分種質具有Csmlo8突變卻表現為白粉病易感的現象。這表明還存在其他抗病位點與Csmlo8共同介導白粉病抗性，黃瓜白粉病抗性的遺傳基礎仍然有待深入挖掘。CsMLO基因家族成員之間存在功能冗余性，前人的正向遺傳學研究結果也發現多個白粉病抗病QTL位點中存在CsMLO家族的其他基因，暗示了其他CsMLO成員與CsMLO8基因共同調控黃瓜白粉病抗性的可能性。因此，對CsMLO基因家族進行系統功能分析將為黃瓜抗病分子育種提供理論基礎。
該研究首先采用II型啟動子cestrum yellowleaf curling virus （CmYLCV） 驅動由tRNAGly 間隔串聯的多個sgRNA，建立了一個高效的黃瓜多基因編輯系統。利用該系統，以易感白粉病的華南型黃瓜CU2種質為受體，對CsMLO基因家族13個成員進行了多基因編輯，獲得了一系列Csmlo單、多突變體。進一步，對這些突變體的白粉病抗性和生長表型進行了系統調查。研究發現敲除CsMLO家族第V分支三個基因CsMLO1/8/11，所得單突變體Csmlo8仍然易感白粉病，所得雙突變體表現為中等白粉病抗性，尤其值得關注的是同時編輯這三個基因的黃瓜三突變體材料Csmlo1/8/11獲得了白粉病完全抗性。然而，并未觀察到五突變體Csmlo3/4/5/9/10白粉病抗性的改變。此外，對多個Csmlo突變體生長表型進行系統觀察還發現，相較于對照為五瓣花和三心室果實，Csmlo3/10突變體中黃瓜六瓣花、七瓣花的數目顯著增多，其四心室果實的比例也大幅提高。這是首次在植物中報道CsMLO家族Ⅱ分支成員的功能。而Csmlo12/13突變則導致雄性不育且葉面積增大的表型。因此，通過對CsMLO家族基因進行多基因編輯，成功獲得了白粉病完全抗性黃瓜材料；對家族突變體白粉病抗性和生長發育表型的系統調查，為利用Csmlo進行黃瓜白粉病抗性育種提供了重要的理論依據。
研究人員進一步基于所得不同抗病程度Csmlo突變體，采用高通量轉錄組與蛋白組關聯分析，發現鈣信號在Csmlo1/8/11介導的白粉病抗性中發揮著重要的調控作用。在Csmlo1/8/11突變體中，鈣信號下游的三個基因CsKIC、CsCML28和CsCPK11的蛋白表達量顯著升高。進一步研究發現，CsKIC與第V分支成員CsMLO1/8/11均存在蛋白互作。通過VIGS瞬時沉默CsKIC，能增強黃瓜白粉病抗病性，這表明與CsMLO8的功能一致，CsKIC是白粉病抗性的負調控因子，猜測CsKIC與CsMLO1/8/11互作協同參與白粉病菌入侵過程。另外，通過VIGS瞬時沉默CsCML28和CsCPK11，觀察到黃瓜白粉病感病性增加；且二者分別與CsMLO1/8共沉默時，部分恢復了由于CsMLO1/8敲低而導致的白粉病抗性。這表明CsCML28和CsCPK11可能在CsMLO1/8的下游發揮正向調控作用，參與介導黃瓜白粉病抗性。最后，通過穩定遺傳轉化得到了CsCPK11過表達植株，與對照相比，其白粉病抗性顯著增強。這些發現為深入理解Csmlo介導的黃瓜白粉病抗性機制提供了關鍵線索。
綜上所述，該研究為瓜類作物生物育種提供了高效的多基因編輯工具，為黃瓜白粉病抗性育種提供了寶貴的基因和種質資源。該研究深入解析鈣信號參與Csmlo1/8/11介導的白粉病抗性分子機制，也為豐富白粉病抗病調控模型提供了新的理論依據。
華中農業大學園藝林學學院別之龍教授和楊麗副教授為本文共同通訊作者，在讀博士生馬明茹和楊麗副教授為第一作者。西北農林科技大學李大偉副教授和華中農業大學孔秋生教授參與了本項研究。本研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、湖北省自然科學基金創新群體和湖北省重點研發項目等課題資助。
日期：2024-02-26
