透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)便常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過程中,除鹽、除少量溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù)。
透析只需要使用的半透膜即可完成。通常是將半透膜制成袋狀,將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi),將此透析袋浸入水或緩沖液中,樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi),而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外,直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”,袋(膜)外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。
透析的動(dòng)力是擴(kuò)散壓,擴(kuò)散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外兩邊的濃度梯度,還正比于膜的面積和溫度,通常是4℃透析,升高溫度可加快透析速度。
透析膜可用動(dòng)物膜和玻璃紙等,但用的多的還是用纖維素(再生纖維素RC、纖維素酯CE、PVDF等)制成的透析膜,目前常用的是美國美國光譜醫(yī)學(xué)公司spectrum和美國unio Carbide聯(lián)合碳化物公司,各種尺寸的透析管,截留分子量MwCO(即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的分子量,縮寫為MwCO)大概有100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000等種類,單位為道爾頓(D)。
商品透析袋制成管狀,其扁平寬度為8 mm~77 mm不等。為防干裂,出廠時(shí)都用10%的甘油處理過,并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì),它們對(duì)蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害,用前必須除去。
1.將透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20cm)的小段,即成透析袋。
2.在大體積的2%(m/v)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(PH=8)中將透析袋煮沸10min。
3.將透析袋用蒸餾水徹底漂洗。
4.將透析袋置1mmol/LEDTA(PH=8)中煮沸10min。
5.透析袋冷卻后存放于4度,應(yīng)確保透析袋始終浸沒在液體中。
注:從此步起用透析袋時(shí)一定要戴手套操作。
6.在使用之前要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗。
注:也可以將透析袋放在廣口瓶中充滿水,松動(dòng)瓶蓋,于20psi(1.40kg/cm2)高壓滅菌10min,代替第四步用1mmol/LEDTA(PH=8)中煮沸10min的操作。
使用后的透析袋洗凈后可存于4℃蒸餾水中,若長(zhǎng)時(shí)間不用,可加少量NaN2,以防長(zhǎng)菌。洗凈涼干的透析袋彎折時(shí)易裂口,用時(shí)必須仔細(xì)檢查,不漏時(shí)方可重復(fù)使用。
新透析袋如不作如上的特殊處理,則可用沸水煮五至十分鐘,再用蒸餾水洗凈,即可使用。
美國美國光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的透析袋大部分是預(yù)處理過的,即用型,使用前只需用蒸餾水沖洗即可使用,spectra/por7系列和生物技術(shù)級(jí)的透析袋基本不含硫化物和重金屬離子。
使用時(shí),一端用橡皮筋或線繩扎緊,也可以使用特制的透析袋夾夾緊,由另一端灌滿水,用手指稍加壓,檢查不漏,方可裝入待透析液,通常要留三分之一至一半的空間,以防透析過程中,透析的小分子量較大時(shí),袋外的水和緩沖液過量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。含鹽量很高的蛋白質(zhì)溶液透析過夜時(shí),體積增加50%是正常的。為了加快透析速度,除多次更換透析液外,還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些,可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。小量體積溶液的透析,可在袋內(nèi)放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管,以使透析袋沉入液面以下。
檢查透析效果的方法是:用1%BaCl2檢查(NH4)2SO4,用1%AgNO3 檢查NaCl、KCl等。
為了提高透析效率,還可以使用各種透析裝置。使用者也可以自行設(shè)計(jì)與制作各種簡(jiǎn)易的透析裝置。美國美國光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種型號(hào)的透析設(shè)備,由于使用對(duì)流透析的原理,使透析速度和效率大大提高。
選用透析袋需要知道目的物質(zhì)的分子量,每次處理的樣品量,同一批次的平行試驗(yàn),是否需要保持目的物質(zhì)的活性來選擇
正確選擇透析膜
透析成功進(jìn)行的關(guān)鍵是在適當(dāng)?shù)臈l件下選用的膜。選擇時(shí)可參照下列六步:
·根據(jù)目的選擇膜的等級(jí)(生物技術(shù)或標(biāo)準(zhǔn))
·根據(jù)溶液的化學(xué)特性選擇膜材質(zhì)(CE、RC)—參見化學(xué)相容性表格
·根據(jù)使用方法選擇產(chǎn)品類型(管狀、即用型)
·根據(jù)溶質(zhì)分子量在18種MWCO中選擇
·根據(jù)處理量在多種尺寸(即用型透析裝置)或多種寬度(管狀)中選擇
·根據(jù)目的選擇膜預(yù)處理方式
關(guān)鍵的選擇
正確選擇合適的截留分子量
截留分子量的選擇是以預(yù)留在膜內(nèi)的大分子的分子量和將要被除去的小分子污染物的分子量為基礎(chǔ)的。使用Spectra/Por?膜時(shí),為達(dá)到合理有效的分離,需分離的兩種物質(zhì)分子量的比率至少為25。
選擇殘留分子量的經(jīng)驗(yàn)法則:選擇截留分子量值約為要保留的大分子分子量的一半,以獲得至少90%的保留率。
膜的化學(xué)相容性表格
化學(xué)相容性表格主要用作使用指導(dǎo),不作為化學(xué)相容性的保證。溫度,濃度,長(zhǎng)時(shí)間曝光等因素的改變可能影響產(chǎn)品的使用。建議您自設(shè)條件進(jìn)行測(cè)試。
正確選擇扁平寬度
透析管扁平寬度的選擇取決于樣品的體積和透析容量。較小的透析管透析更快;較大的透析管因擴(kuò)散距離較長(zhǎng)透析較慢。為易于使用,建議使用總長(zhǎng)(包括閉合夾和頂部空間)為大約10—15厘米的膜管。
目錄和包裝標(biāo)簽都提供“體積/長(zhǎng)度”的比例(ml/cm),供您在選擇時(shí)參考。
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