三、微生物學(xué)驗證：生物指示劑挑戰(zhàn)試驗
核心目標(biāo)：通過定量接種耐熱微生物孢子，驗證滅菌工藝的致死能力(即殺滅對數(shù))。
1. 生物指示劑(BI)選擇
- 菌種：
- 需氧菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)孢子，耐熱性強(qiáng)(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于濕熱滅菌驗證。
- 厭氧菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子，更常用(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于密封罐體滅菌。
- 孢子濃度：每支BI含1×101×10 CFU( colony Forming Unit，菌落形成單位)，確保滅菌后殺滅對數(shù)≥6(即存活概率<10)。
2. 布點與操作
- 布點原則：
- 覆蓋所有可能的滅菌死角：罐體底部排水口、進(jìn)料管末端、空氣分布器、換熱器盤管死角、閥門盲端等。
- 每個關(guān)鍵位置放置2支BI(平行樣)，總布點數(shù)≥10個(小型罐)或≥20個(大型罐)。
- 操作步驟：
1. 將BI放入透氣性包裝(如無紡布)，避免直接接觸蒸汽導(dǎo)致孢子提前失活。
2. 滅菌前按布點圖固定BI，可通過支架或耐高溫膠帶定位。
3. 滅菌后取出BI，一支進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯，5560℃培養(yǎng)4872小時)，另一支作為陽性對照(不滅菌直接培養(yǎng))。
4. 結(jié)果判定：培養(yǎng)后觀察是否有渾濁或菌落生長，若所有BI均無菌生長，視為滅菌合格；若有陽性結(jié)果，需擴(kuò)大驗證范圍并調(diào)整滅菌參數(shù)(如延長保溫時間、提高溫度)。
四、驗證周期與異常處理
1. 常規(guī)驗證周期
- 定期驗證：
- 新建/改造罐體：投產(chǎn)前需通過至少3次連續(xù)成功的驗證(物理+化學(xué)+微生物)。
- 正常生產(chǎn)：每612個月進(jìn)行一次全面再驗證，每年至少一次微生物學(xué)驗證。
- 觸發(fā)再驗證場景：
- 更換滅菌工藝參數(shù)(如溫度從121℃調(diào)整為123℃)、罐體結(jié)構(gòu)改造(如新增管道)、滅菌失敗事件(如染菌批次)后。
2. 異常情況處理
- 物理參數(shù)不達(dá)標(biāo)：
- 檢查蒸汽供應(yīng)(壓力、干度)、疏水閥是否堵塞、罐體保溫層破損等，修復(fù)后重新驗證。
- 化學(xué)/微生物驗證失敗：
- 分析滅菌死角原因(如管道坡度不足導(dǎo)致冷凝水滯留)，通過增加布點、調(diào)整滅菌程序(如預(yù)排水時間從5分鐘延長至10分鐘)或機(jī)械改造(如打磨焊縫消除死角)解決，直至驗證通過。
五、文件記錄與合規(guī)性
1. 驗證報告內(nèi)容：
- 物理參數(shù)記錄(溫度-時間曲線、壓力波動圖)。
- 化學(xué)指示劑變色情況(附照片或圖示)。
- 生物指示劑培養(yǎng)結(jié)果(菌落計數(shù)表、陰性/陽性對照記錄)。
2. 合規(guī)性要求：
- 符合GMP(藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)、FDA(美國食品藥品監(jiān)督管理局)或ISO 13485(醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系)等標(biāo)準(zhǔn)，記錄需存檔至少35年。
- 若用于制藥行業(yè)，需通過PQ(性能確認(rèn))階段的微生物挑戰(zhàn)試驗，證明滅菌工藝的重現(xiàn)性和可靠性。
發(fā)酵罐滅菌效果驗證需遵循“科學(xué)布點、多方法交叉驗證、動態(tài)監(jiān)控”原則，通過物理參數(shù)的精準(zhǔn)控制、化學(xué)指示物的直觀反饋和生物指示劑的定量挑戰(zhàn)，確保滅菌無-死角、工藝穩(wěn)定可靠。
實際操作中，可結(jié)合風(fēng)險評估(如高附加值產(chǎn)品需提高驗證頻次)和數(shù)字化工具(如實時溫度云圖系統(tǒng))提升驗證效-率，最終保障發(fā)酵過程的無菌環(huán)境。
核心目標(biāo)：通過定量接種耐熱微生物孢子，驗證滅菌工藝的致死能力(即殺滅對數(shù))。
1. 生物指示劑(BI)選擇
- 菌種：
- 需氧菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)孢子，耐熱性強(qiáng)(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于濕熱滅菌驗證。
- 厭氧菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子，更常用(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于密封罐體滅菌。
- 孢子濃度：每支BI含1×101×10 CFU( colony Forming Unit，菌落形成單位)，確保滅菌后殺滅對數(shù)≥6(即存活概率<10)。
2. 布點與操作
- 布點原則：
- 覆蓋所有可能的滅菌死角：罐體底部排水口、進(jìn)料管末端、空氣分布器、換熱器盤管死角、閥門盲端等。
- 每個關(guān)鍵位置放置2支BI(平行樣)，總布點數(shù)≥10個(小型罐)或≥20個(大型罐)。
- 操作步驟：
1. 將BI放入透氣性包裝(如無紡布)，避免直接接觸蒸汽導(dǎo)致孢子提前失活。
2. 滅菌前按布點圖固定BI，可通過支架或耐高溫膠帶定位。
3. 滅菌后取出BI，一支進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯，5560℃培養(yǎng)4872小時)，另一支作為陽性對照(不滅菌直接培養(yǎng))。
4. 結(jié)果判定：培養(yǎng)后觀察是否有渾濁或菌落生長，若所有BI均無菌生長，視為滅菌合格；若有陽性結(jié)果，需擴(kuò)大驗證范圍并調(diào)整滅菌參數(shù)(如延長保溫時間、提高溫度)。
四、驗證周期與異常處理
1. 常規(guī)驗證周期
- 定期驗證：
- 新建/改造罐體：投產(chǎn)前需通過至少3次連續(xù)成功的驗證(物理+化學(xué)+微生物)。
- 正常生產(chǎn)：每612個月進(jìn)行一次全面再驗證，每年至少一次微生物學(xué)驗證。
- 觸發(fā)再驗證場景：
- 更換滅菌工藝參數(shù)(如溫度從121℃調(diào)整為123℃)、罐體結(jié)構(gòu)改造(如新增管道)、滅菌失敗事件(如染菌批次)后。
2. 異常情況處理
- 物理參數(shù)不達(dá)標(biāo)：
- 檢查蒸汽供應(yīng)(壓力、干度)、疏水閥是否堵塞、罐體保溫層破損等，修復(fù)后重新驗證。
- 化學(xué)/微生物驗證失敗：
- 分析滅菌死角原因(如管道坡度不足導(dǎo)致冷凝水滯留)，通過增加布點、調(diào)整滅菌程序(如預(yù)排水時間從5分鐘延長至10分鐘)或機(jī)械改造(如打磨焊縫消除死角)解決，直至驗證通過。
五、文件記錄與合規(guī)性
1. 驗證報告內(nèi)容：
- 物理參數(shù)記錄(溫度-時間曲線、壓力波動圖)。
- 化學(xué)指示劑變色情況(附照片或圖示)。
- 生物指示劑培養(yǎng)結(jié)果(菌落計數(shù)表、陰性/陽性對照記錄)。
2. 合規(guī)性要求：
- 符合GMP(藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)、FDA(美國食品藥品監(jiān)督管理局)或ISO 13485(醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系)等標(biāo)準(zhǔn)，記錄需存檔至少35年。
- 若用于制藥行業(yè)，需通過PQ(性能確認(rèn))階段的微生物挑戰(zhàn)試驗，證明滅菌工藝的重現(xiàn)性和可靠性。
發(fā)酵罐滅菌效果驗證需遵循“科學(xué)布點、多方法交叉驗證、動態(tài)監(jiān)控”原則，通過物理參數(shù)的精準(zhǔn)控制、化學(xué)指示物的直觀反饋和生物指示劑的定量挑戰(zhàn)，確保滅菌無-死角、工藝穩(wěn)定可靠。
實際操作中，可結(jié)合風(fēng)險評估(如高附加值產(chǎn)品需提高驗證頻次)和數(shù)字化工具(如實時溫度云圖系統(tǒng))提升驗證效-率，最終保障發(fā)酵過程的無菌環(huán)境。
