概述
采用實(shí)時熒光PCR技術(shù)，針對致瀉大腸埃希氏菌（DEC）特異性基因設(shè)計引物和探針。PCR擴(kuò)增過程中，與模板結(jié)合的探針被Taq酶分解產(chǎn)生熒光信號，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測到的熒光信號繪制出實(shí)時擴(kuò)增曲線，從而實(shí)現(xiàn)致瀉大腸埃希氏菌（DEC）在核酸水平上的菌株鑒定。
檢測步驟
1、核酸提取
加熱法：刮取一環(huán)菌落，懸浮于100μL的無菌水中，漩渦震蕩10s（如果菌落未能均勻分散，可適當(dāng)延長震蕩時間），95℃或沸水浴5min，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，吸取上清。
試劑盒法：可使用商品化的試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA。
2、反應(yīng)體系配置
從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，取20μL置于PCR管或PCR板中，然后各取模板5μL分別加入PCR管或PCR板中（每種模板要使用五種預(yù)混液），蓋好管蓋或板膜，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
3、PCR擴(kuò)增
PCR管或PCR板置于PCR儀上，推薦反應(yīng)程序設(shè)定如下：反應(yīng)體系為25μL，在第二步每個循環(huán)60℃時檢測熒光信號，檢測通道選擇FAM、HEX（VIC）、CY5。
注：使用ABI系列PCR儀器，如果不添加ROX
注意事項
1、實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀說明書，規(guī)范操作。
2、本品各組成成分均不得與其他產(chǎn)品或不同批號產(chǎn)品中的相應(yīng)組成成分進(jìn)行混用。
3、基因變異可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
4、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染、試劑污染、樣品交叉污染都可能會造成假陽性結(jié)果。
5、恰當(dāng)處理實(shí)驗(yàn)過程中的廢棄物和擴(kuò)增產(chǎn)物。
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