高通量測序分析環境微生物（微生物菌群分析、微生物多樣性分析）

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  研究對象：

樣品來源：土壤、海洋、活性污泥、動物腸道、糞便、酒曲、窖泥、發酵液、菌劑、食品等；

樣品形式：環境樣品、基因組DNA、PCR產物；

根據客戶提供的樣本（環境樣本、基因組DNA、PCR產物）及需要檢測的微生物多樣性類型（細菌、古菌、真菌），利用Roche 454測序平臺對目的片段進行高通量測序，并對測序結果進行生物信息學的分析。

MiSeq 高通量測序平臺

Illumina公司開發的MiSeq測序儀，它是Illumina公司于2011年2月推出的小型測序平臺，是一臺內置簇生成和數據產生的測序儀，具有測序速度快，數據準確的優點，可實現300bp×2的測序長度，具備革命性的便捷流程。

性能參數：

環境微生物群落多樣性分析，基于Roche 454 FLX +、IlluminaMiSeq等第二代高通量測序平臺，對核糖體RNA高變區域，比如16S/18S/ITS等序列；或功能基因，比如細菌和古菌的氨氧化酶基因進行測序，揭示環境樣品中眾多不同類型微生物種類以及它們之間的相對豐度和進化關系。探討微生物多樣性，對于研究微生物與環境的關系、環境治理和微生物資源利用有著重要的理論和現實意義。

優勢

★ 采用定向測序技術，避免了非定向測序造成的數據冗余，能充分利用每條有效序列，且便于后期的菌群分類處理。
★ 開發了一套穩定的多樣本平行測序實驗方案，并解決了樣本間數據量不平衡的技術難題，一次可實現200個樣品的平行測序。
★ 環境微生物群落多樣性分析有Roche 454 FLX +和Illumina MiSeq兩種高通量測序平臺可供選擇，根據不同的測序要求提供不同的解決方案。
★ 眾多的成功案例，使寶杰羅生物在環境微生物群落多樣性測序及分析方面處于國內地位。

技術路線

生物信息分析流程

研究內容

1. 數據統計分析
2. 數據根據Barcode信息回歸樣品
3. OTU（Operational Taxonomic Units）聚類
4. 稀釋性曲線（Rarefaction Curve）

圖2 稀釋性曲線

5. 分類學分析（Silva數據庫）
6. 菌群多樣性、豐度和測序深度指數計算
7. 多樣品間兩兩sharedchao、sharedace指數計算
8. 組間顯著性差異分析
9. 群落結構分析

圖 3單樣品群落結構餅圖 圖 4多樣品群落結構柱狀圖

10. 分類學樹狀圖

圖 5單樣品分類學樹狀圖 圖 6多樣品分類學比對樹狀圖

11. 多樣品相似度比對

圖 7 多樣品相似度比對樹狀圖 圖 8 多樣品相似度比對heatmap圖

12. 樣品OTU分布比較

圖 9樣品OTU分布比較Venn圖

13. PCA（Principal component analysis）分析

圖 10 PCA分析

14. Weighted and unweighted unifrac PCA分析

圖 11 Weighted unifrac PCA分析

送樣要求 1

1. 樣品類型： DNA
2. 樣品需求量：≥500ng
3. 樣品濃度： ≥10ng/μL
4. 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無降解
5. 樣品保存期間切忌反復凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸。

送樣要求 2

1. 樣品類型： PCR產物
2. 樣品需求量：≥100ng
3. 樣品濃度： ≥5ng/μL
4. 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保PCR產物無降解
5. 樣品保存期間切忌反復凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸。
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